Relação entre atividade de plasmina e frações de caseína durante o armazenamento do leite longa vida

A plasmina é uma enzima endógena do leite classificada como uma proteinase alcalina, análoga à enzima sérica do soro sanguíneo bovino; encontra-se associada às frações de caseína no leite, sendo responsável por aproximadamente 90% da proteólise total que ocorre no leite (FERNANDES e OLIVEIRA, 2007). A plasmina degrada β-, αs₁- e αS₂-caseína, sendo que esta atividade proteolítica é maior em leites provenientes de vacas com mastites, em função do aumento na contagem de células somáticas (CCS) no leite (BASTIAN e BROWN, 1996). Diferentemente da plasmina, as proteases produzidas por microrganismos psicrotróficos no leite causam proteólise com maior intensidade nas frações β- e κ-, seguidas da αs₁-caseína (ISMAIL e NIELSEN, 2010; FERNANDES et al., 2008).

A plasmina compõe um sistema complexo, que inclui o plasminogênio, os ativadores de plasminogênio, os inibidores dos ativadores do plasminogênio e os inibidores da plasmina (FERNANDES et al., 2008). Verdi e Barbano (1991) demonstraram que as células somáticas no leite apresentam a capacidade de conversão de plasminogênio em plasmina, resultando em proteólise da caseína, o que confirma a associação entre a alta CCS e o aumento da atividade proteolítica da plasmina. No entanto, os componentes do sistema plasmina interagem entre si (BASTIAN e BROWN, 1996) e com outros componentes do leite, como a caseína (METWALLI et al., 1998) e as proteínas do soro (ISMAIL e NIELSEN, 2010; SAINT-DENIS et al., 2001), promovendo ou inibindo a proteólise, dependendo da intensidade do tratamento térmico e das condições de armazenagem do leite.

O leite longa vida se destaca por ser um produto de prateleira estendida, o que proporciona comodidade ao consumidor, principalmente em grandes centros urbanos. As vendas deste tipo de leite no Brasil representam 74% do volume total de leite fluido comercializado no país (ABLV, 2009). Considerando-se a importância econômica do leite longa vida no mercado e na dieta da população brasileira, existem poucos dados na literatura sobre os fatores que afetam a qualidade do produto nessas condições. Um dos principais problemas que afetam a qualidade do leite longa vida durante o armazenamento é a precipitação indesejável, ou a gelificação, ocasionando uma redução na sua vida útil. A ação proteolítica da plasmina sobre as frações de caseína do leite tem sido sugerida como um dos fatores causais da gelificação do leite longa vida durante o armazenamento (FERNANDES et al., 2008), tendo em vista que a plasmina é uma enzima termoestável, capaz de sobreviver à pasteurização e ao tratamento por esterilização do leite (KOHLMANN et al., 1988). O objetivo do presente trabalho foi verificar a relação entre a atividade de plasmina e as concentrações das frações de caseína no leite longa vida integral durante 120 dias de armazenamento.

 

O leite longa vida utilizado no experimento foi produzido em usina de beneficiamento localizada no município de Casa Branca-SP, utilizando-se lotes de leite cru recolhido em propriedades leiteiras associadas à indústria e entregue na usina em caminhões isotérmicos. Antes do início de cada lote de leite ser processado (8.000-15.000 L/lote), foram colhidas amostras em duplicata de 600 mL do leite cru armazenado no tanquesilo, para realização da contagem de células somáticas (CCS) por meio de contador eletrônico (Bentley, Chaska, Minnesota, USA), determinação da atividade de plasmina (SAINT-DENISet al., 2001) e contagem de microrganismos mesófilos e psicrotróficos (APHA, 2004). Cada amostra foi composta por dez subamostras de 60 mL de leite, coletadas em intervalos de cerca de 10 minutos, durante a transferência do leite do tanque-silo para o tanque de equilíbrio do pasteurizador. Consideraram-se, como critério de inclusão no estudo, quatro lotes de leite cru cujas duplicatas analisadas apresentaram até 1,0 × 10⁴ unidades formadoras de colônias (UFC) mL^–1 para mesófilos e 1,0 × 10³ UFC mL^–1 para psicrotróficos (LÜCK, 1987).

O leite cru foi submetido à pasteurização rápida (HT-ST) em trocadores de calor a placas, sendo pré-aquecido a 50 °C, clarificado em centrífuga, aquecido a 72-75 °C por 15-20 segundos, imediatamente resfriado a 4 °C e estocado temporariamente em balão isotérmico, até o início do processamento para obtenção do leite longa vida. Em seguida, o leite tratado resfriado foi previamente aquecido a 85 °C em trocadores tubulares, seguindo posteriormente na linha para injeção de vapor superaquecido, até atingir a temperatura de 132-135 °C, por 2-8 segundos. Na sequência do processo, o leite foi submetido à evaporação em câmara de vácuo parcial (–0,6 MPa), na qual sofreu um primeiro resfriamento até cerca de 70 °C, e à passagem em homogeneizadora de dois estágios (22-25 MPa), retornando ao trocador tubular para um segundo resfriamento à temperatura de cerca de 20 °C. O produto foi envasado automaticamente em embalagens assépticas cartonadas de 1 L, em sistema de torre (TetraPak®). Todas as unidades produzidas em cada lote ficaram retidas na usina até o término do período de observação de amostras do lote, mantidas em estufa a 35 °C por sete dias. Após a liberação de cada lote pela empresa, foram reservadas dez unidades do produto para fins de análises laboratoriais, as quais foram armazenadas à temperatura ambiente (22-27 °C) durante 120 dias. As análises foram efetuadas nos quatro lotes de leite longa vida, aos 10, 30, 60, 90 e 120 dias após a fabricação.

A atividade da plasmina no leite longa vida foi determinada por meio da metodologia descrita por Saint-Denis et al. (2001). Para avaliar a atividade da plasmina, amostras de leite (1 mL) foram pré-incubadas por 10 minutos a 37 °C com 1 mL de tampão Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), contendo ácido ε-aminocaproico 8 mM e NaCl 0,4 M, e gelatina (4 g.L–1), com objetivo de dissociar a plasmina das micelas de caseína. A atividade da plasmina foi determinada quantificando-se a concentração de 7-amido-4-metil cumarina (AMC), um produto fluorescente liberado pela plasmina a partir de um peptídeo (PIERZCHALA, 1979). A quantificação de AMC foi realizada em detector de fluorescência (Shimadzu, Japão) equipado com célula para cubetas de 1 cm de percurso óptico, utilizando-se excitação a 370 nm e emissão a 440 nm. A curva de calibração foi preparada utilizando-se soluções padrão contendo 0,5, 1,25, 2,5 e 5,0 µg.mL^–1 de plasmina, preparadas de acordo com Saint-Denis et al. (2001). Os resultados foram expressos em unidades Sigma (US), considerando 1,0 US=1,0 mM AMC liberado no ensaio.

As frações individuais de caseína do leite foram determinadas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), seguindo rigorosamente os procedimentos descritos por Fernandes et al. (2008). A separação e a identificação preliminar das proteínas foram realizadas no sistema CLAE (Shimadzu, Japão), equipado com detector de luz UV e coluna Júpiter C18 (4 µm, 4,6 × 150 mm) (Phenomenex, Torrance, USA). As amostras foram filtradas através de membrana de PTFE 0,45 µm (Millipore, USA), sendo que 20 µL da solução foram injetados no sistema CLAE. A corrida cromatográfica foi realizada em temperatura ambiente, nas condições preconizadas por Bobe et al. (1998), detalhadas a seguir. Fases móveis: misturas de solventes A (acetonitrila+água+ácido trifluroacético–100:900:1) e B (acetonitrila+água+ácido trifluroacético – 900 : 100 : 1). O programa de gradiente foi iniciado com 25% do solvente B, aumentando-se gradativamente a proporção do solvente B imediatamente após a injeção da amostra [34% (4 minutos), 48% (11 minutos), 50% (13 minutos), 10% (17 minutos)], retornando em seguida às condições iniciais, após 2 minutos; Fluxo: 1,0 mL/minuto; Comprimento de onda do detector: 220 nm. Nestas conduções, os tempos de retenção de αs₁-caseína, αS₂-caseína, β-caseína e κ-caseína foram 10,9 minutos, 9,3 minutos, 11,4 minutos e 8,3 minutos, respectivamente.

Os resultados das análises da atividade de plasmina e das frações de caseína no leite UAT aos 10, 30, 60, 90 e 120 dias de armazenamento foram utilizados para determinar o coeficiente de correlação de Pearson (r). O efeito do tempo de armazenamento em frações de caseína no leite longa vida foi determinado utilizando-se o procedimento proc mixed do SAS® (SAS, 2004). Em todos os casos, a significância foi testada no nível de probabilidade de 0,05.

 

A CCS nos lotes de leite cru utilizados na fabricação do leite longa vida variou de 342.000 a 808.000 células. mL^–1, ou 5,53 a 5,91 Log células.mL^–1 (Figura 1). Os valores de atividade de plasmina variaram entre 172 e 184 US, sendo correlacionados com a CCS do leite cru (r=0,9101; P=0,0263). Esses resultados corroboram os dados reportados por outros autores sobre o aumento da atividade de plasmina em leites provenientes de vacas com alta CCS (BASTIAN e BROWN, 1996).

Figura 1. Contagem de células somáticas (CCS) e concentrações de plasmina nos quatro lotes de leite cru utilizado na fabricação do leite longa vida. A respectiva equação de regressão é: y = 0,0277x + 0,8358 (r = 0,9101; P = 0,0263). *US = Unidade Sigma (1,0 US = 1,0 mM 7-amido-4-metil cumarina).

Tabela 1. Correlações entre as atividades de plasmina sobre as frações de caseína do leite UAT integral durante 120 dias de armazenamento.

A Tabela 1 apresenta os coeficientes de correlação entre os níveis de plasmina e as frações de caseína no leite longa vida nos 120 dias de armazenamento. Constatou-se somente correlação negativa (r = –0,5074; P = 0,0224) entre a atividade de plasmina e a concentração de αs₁-caseína, sendo observada também uma tendência de correlação negativa entre plasmina e β-caseína (r=–0,4408; P = 0,0517). Estes resultados estão de acordo com os apresentados por Srinivasan e Lucey (2002), os quais constataram que a ação da plasmina degrada principalmente as frações αs₁-, αS₂- e β-caseína, sendo que esta atividade foi capaz de alterar as propriedades de coagulação do leite. O aumento na atividade de plasmina no leite longa vida em relação ao leite cru confirma a estabilidade térmica desta enzima, conforme observado por outros autores, em leites pasteurizados (VERDI e BARBANO, 1991; BASTIAN e BROWN, 1996).

A Figura 2 apresenta a evolução da atividade de plasmina e das concentrações de αs₁-caseína no leite longa vida durante o armazenamento por 120 dias. Observou-se que o aumento dos níveis de plasmina ao longo deste período (r = 0,9823; P = 0,0127) foi acompanhado pela redução dos níveis de αs₁-caseína (r=0,7613; P=0,0170). Esta diminuição das concentrações de caseína pode estar associada em grande parte à CCS (FERNANDES et al., 2008), o que predispõe o leite a uma substancial hidrólise da αs- e da β-caseína por proteases, havendo diminuição nos níveis destas frações no leite (VERDI e BARBANO, 1991). De fato, Fernandes et al. (2008) observaram que a CCS foi correlacionada à redução nas concentrações de β-caseína no leite longa vida durante o armazenamento, atribuindo este fato principalmente à plasmina.

Figura 2. Concentrações de plasmina (?) e caseína-αs 1 (?) no leite longa vida durante o armazenamento por 120 dias. As respectivas equações de regressão são: plasmina: y = 13,05x + 172 (r = 0,9823; P = 0,0127); caseína-αs 1 : y = –0,834x + 12,855 (r = 0,7613; P = 0,0170). *US = Unidade Sigma (1,0 US = 1,0 mM 7-amido-4-metil cumarina).

A proteólise das caseínas é variável de acordo com a origem das proteases. As proteases produzidas por microrganismos psicrotróficos causam proteólise com maior intensidade nas frações β- e κ-, seguidas da αs₁-caseína (FERNANDES e OLIVEIRA, 2007). Entretanto, estas proteases parecem não causar problemas até que seja alcançado um nível de, no mínimo, 1,0 × 10⁷ UFC. mL^–1 de psicrotróficos (ARCURI et al., 2004). No presente trabalho, somente foram avaliados lotes de leite cru que apresentaram até 1,0 × 10⁴ UFC.mL^–1 para mesófilos e 1,0 × 10³ UFC.mL^–1 para psicrotróficos. Deste modo, a diminuição dos níveis de αs₁-caseína observada durante o armazenamento do leite longa vida pode ser atribuída à ação proteolítica da plasmina, cuja atividade foi correlacionada à variação da CCS no leite cru utilizado como matéria-prima.

Durante o período de armazenamento do leite longa vida, não foram constatadas, por simples observação visual, alterações de cor ou aspecto nas amostras analisadas. No entanto, a consequência provável e de maior importância das mudanças nas frações de caseína no leite longa vida é a desagregação das micelas de caseína, uma vez que este fenômeno está envolvido em diversas alterações indesejáveis no leite, sobretudo a gelificação durante a vida de prateleira do produto (DATTA e DEETH, 2001).

 

A atividade de plasmina no leite cru foi proporcionalmente maior nos leites com maior CCS, cujos valores aumentaram durante o armazenamento do leite longa vida por 120 dias à temperatura ambiente. Durante esse período, o aumento da atividade de plasmina foi acompanhado de redução das concentrações de αs₁-caseína no leite longa vida.

 

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro (processo n.º 152616/2007-1).

 

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