sequestrante micotoxinas critérios

FATORES QUE INTERFEREM NA PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS.

O crescimento fúngico e formação de micotoxinas são dependentes de uma série de fatores (Figura 1), como a umidade, temperatura, presença de Oxigênio, tempo para o crescimento fúngico, constituição do substrato, lesões à integridade dos grãos causados por insetos ou dano mecânico/térmico, quantidade de inóculo fúngico, bem como a interação/competição entre as linhagens fúngicas. As características genéticas representam um fator cada vez mais decisivo na solução do problema. Esta gama de fatores demonstra que o controle dos mesmos, no sentido de prevenção, muitas vezes se torna muito difícil em nossas condições tropicais, por exemplo, as condições climáticas brasileiras no período de colheita dos cereais, em função do regime pluviométrico, não favorecem a secagem dos grãos, especialmente do milho.

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 1

Os sistemas de secagem e armazenagem instalados também contribuem para a evolução do problema em nossas condições. As temperaturas da massa de grãos no interior dos silos em muitas situações ultrapassam os 18°C recomendados, permitindo um crescimento fúngico intenso, especialmente pela deficiente aeração forçada da maioria das unidades armazenadoras, que mesmo existindo, pelo excesso e má distribuição das impurezas não são efetivas no controle dos pontos de calor dentro do silo. Esta e muitas outras razões proporcionam alta prevalência de micotoxinas como as aflatoxinas como contaminantes rotineiros dos cereais no Brasil e em países de clima similar.

Na Figura 2 estão apresentados os dados de positividade e contaminações médias (aflatoxinas) de amostras de cereais enviadas ao LAMIC desde o início de suas atividades. Apesar de haver uma pequena diminuição na concentração de aflatoxinas nos últimos 3 anos, a positividade vem aumentando gradativamente. Isto indica que o desafio por aflatoxinas que as nossas aves estão sujeitas é ainda maior, mostrando que o controle adequado destes contaminantes é de suma importância.

Figura 2 – Positividade e contaminação médias por aflatoxinas, em amostras enviadas ao LAMIC.

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 2

Para que se tenha idéia da real importância das micotoxinas na avicultura, são apresentados, na Tabela 1, os valores de contaminação máximos recomendados, estabelecidos pelo LAMIC para aves, conforme a idade e o uso dos animais.

Tabela 1 – Limites máximos de micotoxinas recomendados pelo LAMIC para aves de produção

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 3

CONTROLE DAS MICOTOXINAS.

Devido à comprovada natureza tóxica das micotoxinas, existe a necessidade de prevenir a contaminação dos alimentos por parte dos fungos toxigênicos e controlar o crescimento fúngico mediante a manipulação do microambiente que se encontra o alimento. Outros métodos de controle são utilizados para que a redução da concentração de micotoxinas possam estar em níveis seguros, ou a utilização de produtos de degradação não tóxicos, sem que estes processos promovam a diminuição do valor nutritivo dos alimentos descontaminados.

Os métodos para controle das micotoxinas podem ser classificados dentro de duas categorias principais:

Prevenção da contaminação e do crescimento fúngico;
Detoxificação dos compostos tóxicos produzidos pelos fungos.

Prevenção da contaminação e crescimento fúngico.

A prevenção da contaminação por fungos toxigênicos e seu crescimento, pode ser controlada por alguns dos seguintes métodos:

Melhora das praticas agrícolas.

O ataque fúngico aos alimentos pode começar já no campo, mediante a contaminação das colheitas pelos fungos produtores de micotoxinas. Muitas micotoxinas, em particular as aflatoxinas, zearalenona e tricotecenos, podem formar-se durante o período de crescimento das plantas no campo.

Para prevenir esta contaminação, é necessário que se melhorem as praticas agrícolas, como por exemplo, usando sementes de qualidade e livres de fungos, impedindo o ataque dos insetos e as enfermidades das plantas. O uso da genética também representa uma excelente possibilidade de redução da contaminação fúngica. A utilização de híbridos resistentes a fungos ou danos, tanto mecânico como o causado por insetos representarão no futuro a forma mais adequada de impedir o crescimento fúngico.

Durante o processo de colheita é importante que se evite ao máximo atingir fisicamente o cereal, pois o dano mecânico está invariavelmente associado a uma rápida invasão de fungos. Outro fator importante no processo de colheita é a limpeza dos cereais, pois os resíduos que ficam aderidos ou misturados, normalmente são portadores de espécies fúngicas micotoxigênicas. Também, para prevenir a contaminação fúngica é importante implantar boas praticas de armazenamento e boas condições ambientais que impeçam o ataque dos fungos.

Agentes antifúngicos

A contaminação das colheitas pode ser prevenida ou diminuída usando ácidos como o benzóico, sórbico, propiônico, fórmico e acético. Pequenas concentrações destes fungicidas nos alimentos devem ser efetivas a um pH situado um pouco acima do seu pK. Em um maior pH, grande parte deste ácido se encontrará sem dissociar, não apresentando nenhum efeito sobre o crescimento fúngico. Por outro lado, a quantidade de ácido adicionado ao produto armazenado deve estar relacionado com a quantidade de água do mesmo, e deve estar distribuído de uma maneira uniforme através de todo volume a tratar. No entanto, o emprego destes ácidos em sub doses pode levar ao risco de que se produza um incremento na capacidade toxigênica de determinados fungos, representando assim um risco para cereal.

Engenharia genética.

O genoma das plantas tem influência notável sobre as infecções fúngicas e na subseqüente biossíntese de micotoxinas, por isso a importância de desenvolver novas variedades, mediante a engenharia genética, capaz de resistir ao ataque dos fungos ou inibir a produção de toxinas. Pesquisadores tem encontrado hibridos que apresentam diferenças significativas em relação a contaminação por Aspergillus flavus e conseqüente produção de aflatoxinas. Estas diferenças podem ser por diversos fatores, e o genoma da planta pode influir na expressão da biossíntese da micotoxina. Isto pode ser devido a síntese de metabólitos específicos por parte da planta, de igual forma que já se demonstrou que alguns produtos naturais podem reduzir a biossíntese das micotoxinas com melhor eficiência do que inibir o crescimento fúngico.

Controle das condições de armazenamento

O armazenamento das colheitas tem um papel importante na qualidade físicoquímica e microbiológica das mesmas. As espécies fúngicas que se desenvolvem em um dado ambiente depende da umidade, temperatura, presença de microrganismos competidores, da natureza e estado fisiológico do produto. Estes e outros fatores influem decisivamente no metabolismo fúngico e na capacidade para que os fungos utilizem os alimentos para o crescimento e produção de seus metabólitos.

Detoxificação dos alimentos contaminados com micotoxinas.

O melhor método para controlar a contaminação por micotoxinas dos alimentos é a prevenção, porém quando o produto já esta contaminado e vai ser usado como alimento, é necessário eliminar ou diminuir esta contaminação.

A prevenção da produção de micotoxinas abrange prevenção de biossíntese e metabolismo de toxinas no campo e na armazenagem. A descontaminação após a produção de micotoxinas refere-se ao tratamento pós-colheita para remover, destruir ou reduzir o efeito tóxico. É difícil impedir a formação de micotoxinas no campo ou na estocagem, entretanto, o monitoramento poderia impedir que as micotoxinas se tornassem uma significativa fonte de riscos à saúde, pois o conhecimento da contaminação permitiria a adoção de medidas estratégicas para minimizar o risco.

Estratégias adotadas na pré ou pós-colheita seriam apropriadas e dependeriam principalmente das condições climáticas de cada ano em particular. Compreender os fatores ambientais que promovem a infecção, crescimento e produção tóxica é um passo importante para um plano efetivo que vise minimizar a ocorrência de micotoxinas em alimentos e em rações.

A F.A.O. instituiu uma série de critérios para determinar se o processo de descontaminação pode ser aceito, o qual deve:

Destruir, inativar ou eliminar a toxina;
Não produzir resíduos tóxicos ou carcinogênicos nos produtos finais, ou em alimentos obtidos a partir de animais que se alimentaram de uma dieta detoxificada;
Manter o valor nutritivo e a aceitabilidade do produto;
Não alterar as propriedades tecnológicas importantes de forma significativa;
Destruir todos os esporos e micélios fúngicos para que não possam, em condições favoráveis, proliferar e produzir novas micotoxinas.

Métodos de descontaminação

Métodos físicos

Métodos físicos incluem moagem, que tem apresentado sucesso para deoxinivalenol, e separação por densidade, que em alguns casos reduziu os níveis de tricotecenos e zearalenona. O carvão ativo é parcialmente efetivo na redução da ação da toxina T-2, comprovado pela diminuição de lesões orais em animais de laboratório, porém a mortalidade ainda ocorre.

O beneficiamento de grãos vem demonstrando ser capaz de reduzir os níveis tanto fúngicos como de micotoxina, sendo esta redução dependente da espécie fúngica e tipo de toxina.

Métodos físicos e eletrônicos de separação e controle de espécies contaminantes em amendoim tem sido extremamente usados por industrias que beneficiam este produto para reduzir os níveis de aflatoxinas, já que estes grãos estão destinados a consumo humano. Mas esta não tem sido a forma mais eficiente de detoxificação, pois os produtos que não tem evidência visível do prejuízo ocasionando por fungo podem ainda assim conter micotoxinas em níveis significativos.

Métodos químicos

A detoxificação de produtos contaminados por inativação através de reações químicas, alta pressão ou extração, usando um solvente orgânico ou uma combinação destes, tem sido avaliada para o problema de aflatoxina desde de 1960. A degradação de aflatoxinas também pode ocorrer, durante o processamento de alimentos e também pelo uso de aditivos, os quais são compostos relativamente seguros em certos níveis utilizados. Esta classe de micotoxinas tem sido a mais estudada pelos diferentes métodos de detoxificação.

A utilização de amônia para descontaminação de produtos agrícolas contaminados por aflatoxinas, tem demonstrado-se muito eficiente.

É importante evidenciar que micotoxinas existem juntamente com outros compostos em alimentos e rações, que podem interagir entre si, influindo na sua toxicidade, sendo este efeito favorecido pelo aquecimento.

Métodos microbiológicos

Outra forma de descontaminação é o processo fermentativo. Durante o processo fermentativo utilizado na produção de pães a partir de grãos de trigo contaminados com deoxinivalenol, foi observada a redução dos níveis atribuída à fermentação e ao processo térmico ao qual o produto foi submetido. Esta descontaminação ocorreu devido à possibilidade da levedura adsorver as toxinas presentes, reduzindo a contaminação.

Experimentos de fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae com mosto contaminado com deoxinivalenol e zearalenona mostraram resultados onde após 7-9 dias de fermentação o DON foi estável ao processo. Do conteúdo inicial de zearalenona, 69% foi convertido a β-zearalenol (β-ZEL), e 8,1% a α-zearalenol. A maior parte de metabolização da zearalenona ocorreu no 1º e 2º dias de fermentação, mostrando a instabilidade da toxina frente à fermentação. Outras pesquisas demonstraram bons resultados de inibição na produção de aflatoxinas utilizando microrganismos como: Bacillus spp (98%), A. flavus e A. parasiticus (90%) e Trichoderma spp (75%).

Utilização de Adsorventes no sistema de produção animal.

O sistema ideal para detoxificar as rações animais deve levar em consideração não somente a redução das micotoxinas, mas também que a substância empregada não houvesse produtos de degradação tóxica nem, tampouco, reduzir o valor nutritivo dos alimentos tratados. Com o crescente problema da contaminação por micotoxinas, a adição na dieta de compostos adsorventes nutricionalmente inertes tem sido uma importante ferramenta.

Os adsorventes são produtos de alto valor no setor farmacêutico, como excipiente de medicamentos, na industria petroquímica, como catalisadores e outros. Na industria de alimentação animal, o emprego de argilas selecionadas e processadas está sendo a cada dia mais utilizado para o seqüestro das micotoxinas, com o objetivo de reduzir a absorção das mesmas pelo trato gastrointestinal de aves e suínos.

CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO DE ADSORVENTE.

Do ponto de vista técnico, são considerados 2 os critérios para que um produto seja selecionado como adsorvente de micotoxinas: os resultados de avaliações in vitro e in vivo. Entretanto, para que um produto seja liberado para comercialização no Brasil, este deve ser devidamente registrado no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). O registro somente é obtido após a realização de uma avaliação in vivo do produto que demonstre que este funcione. Para manutenção do registro, é necessário apresentar, anualmente, um laudo de avaliação in vitro com resultado satisfatório. Tanto as avaliações in vivo como in vitro devem ser realizadas em laboratório credenciado pelo MAPA.

Avaliação in vitro

As avaliações in vitro de um adsorvente têm por objetivo principal, determinar a capacidade que tal produto tem de adsorver as micotoxinas presentes em um meio líquido e torná-la indisponível. As primeiras metodologias descritas para estes estudos foram desenvolvidas há praticamente 20 anos (Phillips et al., 1988) e utilizavam como veículo para a aflatoxina, uma solução hidroalcoólica. Atualmente, muito se utiliza destas metodologias, no entanto, quando no organismo animal, o adsorvente é submetido a muitas situações que não estão presentes em ensaios com solução hidroalcoólica, como variações no pH das soluções e presença de enzimas e outras substâncias.

Em pesquisa financiada pelo USDA (Departamento de Agricultura dos Estados Unidos), Lemke et al. (2001), sob a coordenação de T.D. Phillips, descrevem uma série de metodologias de analise in vitro de argilas, para adsorção de micotoxinas. Neste estudo, uma das metodologias avaliadas foi baseada na mimetização das condições que o adsorvente encontra no local de sua ação no organismo, ou seja, no trato gastrointestinal (TGI). Os pesquisadores levaram em consideração vários fatores, como pH do meio, a presença de enzimas digestivas e o tempo de contato entre adsorvente e micotoxina. Estudos anteriores (Ruby et al., 1993) também apresentaram metodologia semelhante.

Girona (1994), desenvolveu uma metodologia de avaliação in vitro de adsorventes de micotoxinas com características semelhantes àquela posteriormente apresentada por Lemke et al. (2001). Estas metodologias apresentam características distintas com relação ao procedimento (quantidade das enzimas, tempo de contato, etc.), no entanto, o fundamento de ambas está baseado na tentativa de imitar as condições do trato gastrointestinal em estudos in vitro.

Muitos produtos podem apresentar resultados diferentes se comparados os testes tradicionais e os que utilizam os sucos do TGI. Geralmente ocorre uma menor taxa de adsorção as avaliações com estes sucos. Isto ocorre, pois muitas argilas perdem parte da sua capacidade adsortiva quando entram em contato com o pH destes sucos e pela presença de outras substâncias, como enzimas, que não estão presentes nas metodologias tradicionais. Esta diminuição na adsorção sob tais condições ocorre devido a características geológicas destas argilas. Sua dissolução no TGI é lenta e, muitas vezes, incompleta (Ruby et al., 1993).

A utilização de modelos do TGI é extremamente útil no caso de avaliação de adsorventes inorgânicos específicos, inclusive porque o metabolismo da aflatoxina B1 é influenciado por variáveis que estão presentes no TGI como o pH do meio, que varia de 1,3 (suco gástrico) a 6,0 (suco intestinal). Algumas reações químicas podem ser catalizadas pelo adsorvente quando em solução hidroalcoólica, o que não ocorre em testes que utilizam o modelo do TGI (Lemke et al., 2001).

Com 20 anos de experiência em análises de micotoxinas e há mais de 8 anos analisando adsorventes, o LAMIC utiliza uma metodologia de análise in vitro destes produtos, baseada nas metodologias aceitas em todo o mundo. Os métodos que utilizam suco gástrico e intestinal representam da melhor forma possível o meio a que o adsorvente será submetido no organismo animal. Nesta metodologia, são preparadas duas soluções: suco gástrico, com pH 2,0 e suco intestinal, com pH 6,0. Ambos estão descritos na Farmacopéia Americana (Pharmacopeia National Formulary, 1990). Estas soluções são fortificadas com micotoxinas em doses altas e, posteriormente, é adicionado o adsorvente. O cálculo da adsorção in vitro é feito baseado na resposta cromatográfica, utilizado tanto a cromatografia liquida normal (HPLC) quanto os modernos sistemas de cromatografia acoplada a espectrometria de massa (GCMS e LCMS/MS), do suco contendo o adsorvente frente a um suco sem o mesmo.

De acordo com a metodologia utilizada no LAMIC para avaliação in vitro de um adsorvente (suco intestinal e suco gástrico) e considerando-se que o resultado de adsorção é uma média da triplicata do produto em cada solução, com um coeficiente de variação máximo permitido de 5 %, preconiza-se como índice mínimo aceitável de 90 % de capacidade de adsorção em cada suco. O laboratório já testou mais de 300 adsorventes provenientes de diversos países do mundo (Alemanha, Argentina, Áustria, Bélgica, Brasil, Chile, Colômbia, Cuba, Espanha, Hungria, Itália, México, Paquistão, Peru, Republica Dominicana e USA), além dos produzidos neste País e de acordo com os resultados obtidos mais de 50 % apresentam capacidade de adsorção in vitro acima de 90 %, o que proporciona uma grande variabilidade de produtos para atender ao setor de produção animal.

Avaliação in vivo

Para avaliação in vivo de um adsorvente o LAMIC possui uma unidade experimental própria para testes realizados com aves e uma unidade experimental para suínos, através de um acordo de cooperação cientifica com o setor de suinocultura da UFSM. Para ambas espécies animais o laboratório possui um protocolo experimental padrão que é constituído de dois tratamentos controles, um para a micotoxinas utilizada e outro para o produto testado, um tratamento livre de micotoxinas e adsorvente (branco) e um tratamento com a micotoxina e o adsorvente testado de acordo com as doses preconizadas. Conforme a necessidade pode-se acrescentar mais tratamentos com diferentes concentrações da micotoxina e adsorvente. Normalmente os parâmetros avaliados são ganho de peso, conversão alimentar, consumo e peso relativo de órgãos. O período mínimo utilizado para testes com aves é de 21 dias e suínos 28 dias. O laboratório define como critério para aprovação de um adsorvente testado in vivo, utilizando-se aves ou suínos, que o grupo de animais intoxicados com a presença de adsorvente na ração apresente um ganho de peso diferente estatisticamente do grupo intoxicado porém sem a adição do adsorvente.

Outro critério a ser observado é a inocuidade do adsorvente, que deverá apresentar resultado igual ao do grupo controle.

RESULTADOS DE AVALIAÇÕES DE ADSORVENTES.

Avaliações in vitro

Foram realizadas mais de 480 análises de produtos adsorventes. Os resultados destas avaliações estão apresentados nas Figuras 3 e 4.

De acordo com os critérios descritos acima, onde um produto, para ser aprovado deve apresentar adsorção igual ou superior a 90%, até o ano de 2005, apenas 52,48% dos produtos avaliados apresentaram resultados satisfatórios. Entende-se por resultado satisfatório, que o produto deva ter comportamento similar nos dois compartimentos do sistema digestório.

Figura 3 – Percentual de adsorção in vitro de Aflatoxina B1 em pH 2,0 de 228 produtos analisados pelo LAMIC.

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 4

Figura 4 – Percentual de adsorção in vitro de Aflatoxina B1 em pH 6,0 de 256 produtos analisados pelo LAMIC.

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 5

Avaliações in vivo

As avaliações in vivo são realizadas em uma unidade experimental localizada no próprio LAMIC, o que facilita a avaliação dos produtos. Neste sistema, foram testados mais de 16 produtos, sendo que a maioria apresentou resultados satisfatórios. A maioria dos produtos testados in vivo apresentaram adsorção igual ou superior a 90% nas avaliações in vitro realizadas, também, no LAMIC. A Tabela 2 apresenta o resultado dos testes in vivo de dois produtos. O produto A apresentou 94% de adsorção no teste in vitro, enquanto o prduto B apresentou 91% de adsorção no mesmo teste. Fica claro que um resultado satisfatório na avaliação in vitro não é suficiente para que um produto comprove sua aficácia, sendo necessária a comprovação através do teste in vivo. Isto ocorre devido ao fato de que, mesmo reproduzindo as condições do meio, através dos sucos do TGI, o teste in vitro é apenas uma simulação. Quando ingerido pelo animal, juntamente com os componentes da dieta, o adsorvente pode ter sua ação dificultada por um ou mais destes componentes, que não estão presentes nos ensaios in vitro (Lemke et al., 2001). O teste in vivo é muito importante para o controle de qualidade de produção do adsorvente por isso é recomendado que os produtos sejam periodicamente avaliados também em testes in vivo.

Tabela 2 – Peso médio de aves intoxicadas com aflatoxinas, com e sem a adição de adsorvente, por um período de 21 dias.

Critérios para seleção de um bom sequestrante para micotoxinas. - Image 6

ESTIMATIVA DE MERCADO DE ADSORVENTES DE MICOTOXINAS.

Pelos resultados apresentados na Figura 2, fica evidente que a maioria das rações consumidas pelas aves de corte no Brasil apresente contaminação por aflatoxinas ou outras micotoxinas. Este fato, aliado à média relativamente alta de contaminação dos grãos de milho, e aos níveis máximos de aflatoxinas para aves (Tabela 1), mostra a real importância destas micotoxinas na produção de aves em nosso país. Para prevenir maiores danos causados pela aflatoxicose nas aves, estima-se que cerca de 68% das rações produzidas para frangos de corte deveriam ter em sua formulação a inclusão de um produto adsorvente. Se tomarmos como média uma inclusão de 0,25% (2,5 kg/Ton), estamos falando de praticamente 39 mil Toneladas de adsorventes consumidas no ano de 2005 no Brasil.

Pelo risco deterimnado pela faixa etária das aves e considerando os problemas técnicos relacionados ao monitoramento adequado das micotoxinas, é prudente admitir uma inclusão de adsorvente em 100% das rações para fase inicial. Em rações para fase de crescimento, com monitoramento de micotoxinas, admite-se uma inclusão média de 80% de adosrvente nestas dietas e, excepcionalmente, 20% em dietas de fase final, quando da incidência elevada associada a uma contaminação significativa em níveis médios elevados. Portanto, o monitoramento da matéria-prima deverá sempre estar atrelado ao uso do adsorvente, sendo este utilizado, desta forma, em consonância com as normas técnicas de utilização de um produto, quando este for definitivamente necessário na dieta. Com isto, evita-se o desperdício de recursos por parte das empresas avícolas.

Pelo montante consumido, não é surpresa que haja uma grande variedade deste tipo de produtos oferecidos em nosso país, havendo espaço para alguns produtos com eficácia não comprovada. Por isso, torna-se de extrema importância a exigência, por parte das indústrias consumidoras destes produtos, as provas de que o seqüestrante realmente funcione. Estas "provas", nada mais são, do que os resultados das avaliações in vitro, realizadas anualmente e dos testes in vivo.

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