Bacillus Cereus em produtos lácteos – uma revisão

O grupo Bacillus cereus, também denominado Bacillus cereus sensu lato, compreende Bacillus cereus sensu stricto e outras cinco espécies estreitamente relacionadas: Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e Bacillus weithenstephanensis (LECHNER et al., 1998; JENSEN et al., 2003; BARTOSZEWICZ et al., 2008; GUINEBRETIÈRE et al., 2008, SENESI & GHELARDI, 2010).

B. cereus é uma bactéria amplamente encontrada na natureza, apresenta-se na forma de bastonete, Gram-positiva, aeróbia e formadora de esporo. Sua temperatura ótima de multiplicação varia de 25 a 37ºC, mas existem espécies psicrotróficas e termodúricas, capazes de multiplicar entre 3 e 75ºC (KRAMER & GILBERT, 1989; DROBNIEWSKI, 1993; DUFRENNE et al., 1995).

As células de B. cereus são grandes, com cerca de 1,0 a 1,2 μm de largura e 3,0 a 5,0 μm de comprimento, apresentam motilidade associada à flagelos peritríqueos (KRAMER & GILBERT, 1989; RAJKOWSKI & BENNET, 2003). B. cereus é considerado um micro-organismo termodúrico, uma vez que seus esporos podem sobreviver aos processamentos térmicos utilizados na indústria de alimentos (BRADSHAW et al., 1975; GAILLARD et al., 1998; CRONIN & WILKINSON, 2008). Os endósporos de B. cereus são resistentes a condições ambientais extremas, tais como, tratamento térmico e desidratação. Quando a condição é favorável os esporos podem germinar e se multiplicar nos alimentos processados (ABEE et al., 2011).

A termorresistência dos esporos de B. cereus pode variar de acordo com a estirpe (MAZAS et al., 1999; CRONIN & WILKINSON, 2008). Bradshaw et al. (1975) ao avaliarem duas estirpes de esporos de B. cereus, constataram uma estirpe termorresistente, com um valor D121,1 de 2,35 minutos (z = 7,9ºC). Dufrenne et al. (1995) identificaram várias estirpes de B. cereus psicrotróficas e formadoras de esporos com valor D90 entre 2,8 a 9,2 min e, uma delas, com valor D90 superior a 100 min.

B. cereus tem sido isolado de uma grande variedade de alimentos processados e in natura, entre eles, arroz e massas, fórmulas infantis, vegetais, pimentas, alimentos prontos para comer, leite e derivados lácteos (SENESI & GHELARDI, 2010; CHAVES et al., 2011).

O tratamento térmico aplicado ao leite estimula a germinação dos esporos de B. cereus que, na ausência da microbiota competitiva, encontram condições favoráveis para multiplicar-se no produto (WATANUKI & GALLO, 2008). Os esporos de B. cereus germinam após o tratamento térmico do leite, uma vez que a temperatura ótima de ativação é de 65 a 75ºC, ou seja, faixa de temperatura utilizada na pasteurização do leite. A maioria dos esporos (95%) dos esporos podem ser ativados após o processo de pasteurização (MEER et al., 1991).

Algumas estirpes podem se multiplicar em temperaturas de refrigeração (DUFRENNE et al., 1995; GARCÍA-ARMESTO & SUTHERLAND, 1997; LARSEN & JORGENSEN, 1999; GUINEBRETIÈRE et al., 2008, ZHOU et al., 2010). A combinação das características termodúrica e psicrotrófica em uma espécie microbiana denota o seu grande potencial deteriorante, considerando que este micro-organismo pode resistir aos principais tratamentos utilizados na indústria de alimentos e produzir lipases e proteases que irão afetar a qualidade do leite e derivados, além de questões de patogenicidade, que representam um problema para a saúde pública (MEER et al., 1991; MATTA & PUNJ, 1999).

 

B. cereus é responsável por dois tipos de doenças de origem alimentar: uma infecção chamada de síndrome diarréica, provocada por uma enterotoxina produzida in vivo, ou seja, produzida no intestino do hospedeiro; e a síndrome emética, uma intoxicação atribuída a uma toxina pré-formada no alimento (DROBNIEWSKI, 1993; AGATA et al., 1995; WIJNANDS et al., 2002, ARNESEN et al., 2008, SENESI & GHELARDI, 2010). A síndrome emética é caracterizada por ocorrência de náuseas e vômito 2 horas após do consumo do alimento contaminado (KRAMER & GILBERT, 1989). Os sintomas da síndrome diarréica são manifestados após 12 horas do consumo do alimento contaminado, os quais incluem náuseas, mal-estar e diarreia. A dose infecciosa é relativamente alta para dos dois tipos. No caso da síndrome diarréica a dose é de 105 a 108 células ou esporos e no caso da síndrome emética o número de células necessárias para produzir a toxina emética ainda não está bem estabelecido (ARNESEN et al., 2008). Ambas as síndromes apresentam duração dos sinais clínicos por cerca de 24 horas (KRAMER & GILBERT, 1989).

A toxina emética, também denominada de cerulida, é um dodecadepipeptídeo, resistente ao calor e ao pH (GRANUM & LUND, 1997). B. cereus produz concentrações de toxina emética significativamente maiores entre 12ºC e 15ºC, comparado a 30ºC (FINLAY et al., 2000), o que reforça a preocupação com sua presença em produtos refrigerados.

Até o presente momento, foram identificados quatro tipos de enterotoxinas: 1) Toxina Hemolítica BL (HBL), uma enterotoxina hemolítica complexa, formada por três proteínas; 2) Enterotoxina Não-Hemolítica (NHE), também composta por três proteínas; 3) Enterotoxina T, uma proteína simples, e; 4) citotoxina K (CytK), outra proteína simples. Há relatos surtos de origem alimentar associados a três destas toxinas, sendo que a enterotoxina T ainda não foi associada a surtos (WIJNANDS et al., 2002; ARNESEN et al., 2008).

Apesar de B. cereus ser um micro-organismo amplamente encontrado na natureza, são raras as estirpes produtoras de toxina emética (ALTAYAR & SUTHERLAND, 2006). Além disso, existe uma grande diversidade entre as estirpes de B. cereus quanto à presença de genes enterotoxigênicos e habilidade de produzir toxinas eméticas. Muitas estirpes são formadoras de enterotoxinas, mas nem todas são capazes de causar doenças (WIJNANDS et al., 2006).

Em um levantamento feito no Brasil com 97 cepas isoladas de alimentos durante três décadas o complexo NHE foi positivo em 85,5% das estirpes para os três genes nheA, nheB e nheC. O complexo HBL (hblA, hblC e hblD) foi encontrado em 62,9% das estirpes e o gene cytK foi encontrado em 45,4% das estirpes. Os autores verificaram que estirpes isoladas do mesmo grupo de alimentos apresentam perfis toxigênicos distintos (CHAVES et al. 2011).

 

A presença de B. cereus já foi relatada em leite in natura, pasteurizado, UHT, leite em pó, leites fermentados, sorvetes e outros derivados lácteos em diversos países (WONG et al. 1988; LARSEN & JORGENSEN, 1997; CHRISTIANSSON et al.,1999; VIDAL-MARTINS et al., 2005; REYES et al., 2007; REZENDE-LAGO et al., 2007; BARTOSZEWICZ et al., 2008; ZHOU et al., 2008). Wong et al. (1988), ao avaliarem 293 amostras de produtos lácteos adquiridos no comércio na China, detectaram a presença de B. cereus em amostras de leite em pó (29%), leite fermentado (17%), picolé (52%), sorvete (2%), leite pasteurizado (2%) e leite pasteurizado aromatizado (2%). Zhou et al. (2010) detectaram a presença de B. cereus em 24 das 40 amostras de sorvete (60%) também coletadas na China. Em 32% das amostras de leite pasteurizado comercializadas em Nova Iorque-EUA foi detectada a presença de Bacillus spp, 9% destas identificadas como B. cereus (FROMM & BOOR, 2004).

A contaminação de produtos lácteos com B. cereus é também relatada em trabalhos de pesquisa realizadas no Brasil. Vidal-Martins et al. (2005) constataram a presença dessa bactéria em 11,8% de amostras de leite UHT comercializadas em São José do Rio Preto-SP. Este resultado pode indicar uma alta contagem de esporos no leite cru, tratamento térmico (tempo/temperatura) insuficiente para a inativação dos esporos ou contaminação pós-processamento. Rezende-Lago et al. (2007) identificaram 58,3% das 120 amostras de leite em pó, cru, pasteurizado e longa vida positivas para B. cereus em Ribeirão Preto-SP. Os autores identificaram uma maior taxa de positividade no leite pasteurizado, comparada ao leite cru, e relacionaram este resultado à contaminação do leite após o tratamento térmico. Algumas estirpes eram produtoras de enterotoxinas, o que indicou o risco potencial à saúde do consumidor ao ingerir produtos contaminados com esse patógeno. Maziero et al. (2010) encontraram 16,36% de 110 amostras de leite UHT comercializadas no estado do Paraná contaminadas por B. cereus, 100% apresentaram atividade proteolítica e 44,4% estirpes apresentaram atividade lipolítica a 30ºC.

Embora a incidência de B. cereus em leite e derivados seja alta, as intoxicações causadas por este micro-organismo associado ao consumo de produtos lácteos são raras, com a ocorrência de casos limitados às residências, em geral não notificados (FDA, 2007). Possivelmente se houvesse um sistema de notificação apropriado, o leite e seus derivados seriam produtos relevantes considerando que a exposição do consumidor a este patógeno por meio do consumo de leite e derivados é considerada alta (NOTERMANS et al., 1997).

Não existe uma legislação brasileira específica para a presença de B. cereus no leite e nos derivados lácteos, com exceção para o leite em pó, em que é estabelecido um limite de 5,0 x103 UFC/g (BRASIL, 2001).

 

As principais fontes de contaminação do leite por B. cereus são o contato direto ou indireto com solo e poeira durante a ordenha e tetos sujos (CHRISTIANSSON et al., 1999, VISSERS et al., 2007). A água residual da lavagem dos equipamentos de ordenha e o tipo de material da cama de animais confinados também são importantes fontes de contaminação (MAGNUSSON et al., 2007). A estocagem do leite cru em tanques de refrigeração pode aumentar a incidência de esporos de B. cereus no leite, considerando que o tempo e a temperatura de estocagem favorecem a sua multiplicação (SVENSSON et al., 2004).

B. cereus apresenta capacidade de adesão e de formação de biofilmes em superfícies de equipamentos utilizados em laticínios, sendo dificilmente removidos pelos procedimentos de higienização rotineiros (SALUSTIANO et al., 2009). A capacidade de formação de biofilmes é observada mesmo em temperaturas de refrigeração (BERNARDES, 2008). A adesão de esporos de B. cereus em superfícies de tanques de refrigeração dificulta a sua remoção por meio dos procedimentos de higienização que incluem a lavagem com água quente e detergente alcalino (SHAHEEN et al., 2010). Os esporos de B. cereus podem se aderir, germinar e multiplicar na superfície dos trocadores de calor. Giffel et al. (1997) comprovaram que as mesmas esti rpes detectadas na superfície dos trocadores de calor foram também detectadas no leite, o que permitiu atribuir aos equipamentos a contaminação pós-processamento.

A contaminação do leite cru por esporos tem sido relatada como a principal causa de presença de B. cereus em leite processado (VAISANEN et al., 1991; LIN et al., 1998; SVENSSON et al., 1999). Semelhança genética entre estirpes de B. cereus detectadas em leite cru, comparadas àquelas detectadas em leite pasteurizado, permitiram comprovar a resistência dessa bactéria aos processamentos térmicos (CHRISTIANSSON et al., 1999; SVENSSON et al., 1999). A presença de B. cereus em leite processado também pode ser associada à ocorrência de contaminação pós-processamento (REZENDE-LAGO et al., 2007), que é considerada um fator crítico na indústria de produtos lácteos (SCHRAFT et al., 1996).

A incidência de B. cereus no leite é maior no verão e na primavera. A sazonalidade de incidência deste micro-organismo pode ser atribuída às condições de manejo do rebanho, já que nas estações mais quentes os animais ficam livres no pasto, onde têm maior contato com o ambiente e, consequentemente, mais expostos à contaminação (SVENSSON et al., 2004; VISSERS et al., 2007; BARTOSZEWICZ et al., 2008).

 

A presença de B. cereus em produtos lácteos tem causado graves problemas para a indústria de laticínios, principalmente as estirpes psicrotróficas, as quais encontram nos produtos processados condições ideais para a sua multiplicação, principalmente pela quase ausência de microbiota competidora nestes produtos. Diferentes estirpes de Bacillus spp. podem apresentar comportamentos distintos sob diferentes temperaturas. García-Armesto & Sutherland (1997) classificaram essas estirpes em três grupos fisiológicos: um deles claramente psicrotrófico, capaz de crescer a 6,5ºC, em 10 dias, mas não cresce a 40ºC em 2 dias; psicrotrófico intermediário, capaz de crescer a 40ºC e a 6,5ºC, e um outro grupo mesofílico, capaz de multiplicar a 30ºC e a 40ºC, mas não a 6,5ºC. As estirpes de B. cereus avaliadas pelos autores apresentaram comportamento predominantemente intermediário.

Algumas características podem explicar a capacidade de determinadas estirpes de B. cereus se desenvolver em baixas temperaturas, por exemplo, a composição dos ácidos graxos da membrana celular. Estirpes psicrotróficas de B. cereus têm maiores concentrações de ácidos graxos insaturados na membrana lipídica, comparadas às concentrações observadas em micro-organismos mesófilos (COUSIN, 1982). Os ácidos graxos insaturados permitem maior a fluidez da membrana sob baixas temperaturas. Portanto, pode-se dizer que a temperatura mínima de multiplicação do B. cereus tem relação direta com a composição de ácidos graxos da sua membrana celular (VAISANEN et al., 1991). Estirpes psicrotróficas de B. cereus apresentam maior capacidade de germinação e multiplicação em produtos lácteos com alto teor de gordura, devido à hidrofobicidade dos seus esporos (LARSEN & JORGENSEN, 1997). Os lipídeos conferem um caráter protetor aos esporos, uma vez que a gordura apresenta baixa condutividade térmica (MEER et al., 1991).

Células vegetativas de estirpes psicrotróficas de B. cereus apresentam fase lag inferior a 2 dias e tempo de geração entre 9,4 e 75,2 horas em leite refrigerado a 7ºC (DUFRENNE et al., 1995). Quando o leite é mantido a 10ºC, a fase lag passa a ser de 24 horas e o tempo de geração passa a ser de 4 horas (MEER et al., 1991).

Esporos de B. cereus mesófilos são mais termorresistentes que os esporos de B. cereus psicrotróficos. No entanto, os esporos psicrotróficos também podem sobreviver à pasteurização (GIFFEL et al., 1997; SVENSSON et al., 2004; PLANCHON et al., 2011). A germinação de esporos de B. cereus psicrotróficos ocorre a 7ºC, o que pode ser considerado um problema para produtos lácteos (LARSEN & JORGENSEN, 1999; DUFRENNE et al., 1994). Giffel et al. (1997) verificaram que 53% das cepas de B. cereus se multiplicaram a 7ºC. Meer et al. (1991) relataram que 25% das estirpes de B. cereus isoladas em leite pasteurizado são psicrotróficas e produzem enterotoxinas. Granun et al. (1993) avaliaram 85 estirpes de B. cereus isoladas em produtos lácteos na Noruega, das quais 59% era enterotoxigênica, sendo 15% destas psicrotróficas.

B. cereus pode se multiplicar durante o período de estocagem do leite pasteurizado e a sua contagem no produto pode aumentar significativamente. Larsen & Jorgensen (1999) observaram baixas contagens, entre <10 a 102 UFC/mL, em duas de 27 amostras de leite recém pasteurizado, no entanto, após 8 dias de estocagem a 7ºC, as contagens foram superiores a 105 UFC/mL, sendo 24 das 27 amostras positivas para B. cereus.

 

As alterações associadas às contaminações de produtos lácteos com B. cereus são consideradas importantes sob o ponto de vista tecnológico, uma vez que provocam uma redução do tempo de prateleira e o desenvolvimento de atributos sensoriais indesejáveis (ALMEIDA et al., 2000; CHEN et al., 2004; FROOM & BOOR, 2004; REZENDE-LAGO et al., 2007, DE JONGUE et al., 2010).

Meer et al. (1991) estimaram que 20 a 25% dos problemas de vida útil dos produtos lácteos comercializados nos Estados Unidos foram relacionados com a presença de enzimas produzidas por B. cereus e B. mycoides psicrotróficos Existe uma carência na literatura de dados mais atualizados referentes às perdas econômicas causadas por B. cereus em produtos lácteos.

Espécies do gênero Bacillus sintetizam várias enzimas, como proteases e lipases, as quais podem ser intracelulares ou extracelulares, o que reforça que muitas estirpes apresentam maior atividade extracelular de lipases (CHEN et al., 2004). B. cereus também apresenta atividade proteolítica, sendo esta mais acentuada sobre as caseínas, comparada à atividade sobre as proteínas do soro (CHOUDHERY & MIKOLAJCIK, 1970; JANSTOVÁ et al., 2006; MURUGAN E VILLI, 2009).

A atividade lipolítica de Bacillus é maior em ésteres de cadeia curta, como o butirato, caproato, caprilato e caprato. Monoacilgliceróis e diacilgliceróis são hidrolisados mais rapidamente que os triacilgliceróis (CHEN et al., 2004). As lipases produzidas por Bacillus apresentam alta estabilidade térmica, sendo mais termorresistentes que as proteases. Esta estabilidade está associada à substituição da glicina por um resíduo de alanina no sítio ativo do pentapeptídeo Gly-X-Ser-X-Gly (CHEN et al., 2004).

A presença de lipases em queijos pode causar a hidrólise da gordura, com liberação de ácidos graxos e formação principalmente de ácido butírico, o qual confere sabor saponificado ao produto. O defeito é percebido ao longo da maturação e é comum em queijos de maturação prolongada, como Emmental, Gruyère, Parmesão e também no queijo Prato, de maturação mais longa. (FURTADO, 2005). Em leite UHT, a ação de lipases gera alterações sensoriais, como sabores rançoso, amargo, butírico e de sabão durante a estocagem do produto (ANDERSSON et al., 1981).

A presença de lipases no leite cru pode afetar a qualidade do leite em pó (CHEN et al., 2003). O teor de ácidos graxos livres em leite em pó fabricado com leite cru armazenado por quatro dias é significativamente maior do que no leite em pó fabricado com leite recém ordenhado sendo que não há diminuição da atividade lipolítica durante o processamento do leite em pó (CELESTINO et al., 1997).

O teor de ácidos graxos livres (AGL) aumenta significativamente (0,08 a 0,50 mEq AGL/ kg de gordura) em leite pasteurizado contaminado com B. cereus, armazenado sob refrigeração, por 14 dias. Uma análise sensorial feita com provadores treinados indicou o sabor de ranço nas amostras, considerado um defeito causado pela presença de ácidos graxos livres formados durante a lipólise (FROMM & BOOR, 2004).

B. cereus também produz lecitinase, que atua sobre a membrana fosfolipídica do glóbulo de gordura do leite, causando um defeito conhecido como "bitty cream", caracterizado pela aglomeração dos glóbulos de gordura (DE JONGHE et al., 2010)

As proteases liberadas pelas bactérias psicrotróficas no leite são, em sua maioria, metaloproteases, com a presença de Ca e Zn. A maioria apresenta baixo peso molecular, com resíduos de glicina e alanina, concentrações mínimas de metionina, ausência de cistina e presença da alanina no grupo terminal N. A ausência de pontes dissulfeto entre as cadeias de aminoácidos, por promover uma maior flexibilidade na estrutura primária da enzima, confere grande estabilidade térmica a estas enzimas (MITCHELL et al., 1986).

A presença de Ca²⁺ e de Zn²⁺ na estrutura das proteases também contribui na estabilidade destas enzimas ao calor, com resistência à temperatura de 149ºC, por 7 seg, similar ao tratamento UHT (BARACH et al., 1976).

A degradação da caseína do leite pela ação da protease produzida por B. cereus libera peptídeos de baixo peso molecular que podem causar a formação de sabores indesejáveis no leite (JANSTOVÁ et al., 2006). Esta proteólise provoca uma redução de 4,15% no teor de nitrogênio da caseína com relação a proteína total do leite (MURUGAN & VILLI, 2009).

A proteólise do leite UHT durante a estocagem em temperatura ambiente é o principal limitante de seu prazo de validade, associada a al terações na sua textura, como, aumento da viscosidade, o que ocasiona, em alguns casos, a formação de gel (VIDAL-MARTINS et al., 2005).

Proteases degradam as micelas de caseína, com liberação de componentes solúveis, como polipeptídeos e aminoácidos, os quais são perdidos no soro e, assim, acarreta na redução do rendimento de queijos (CARDOSO, 2006). Em leite em pó, a ação das proteases, além de provocar a formação de sabor amargo, pode reduzir a solubilidade do produto em água (CELESTINO et al., 1997; CHEN et al., 2003).

 

As perdas econômicas associadas à contaminação do leite e seus derivados com B. cereus representam um grande prejuízo para a indústria de alimentos, além dos riscos à saúde pública. Ressalta-se a importância do monitoramento e do controle deste patógeno em todas as etapas da cadeia produtiva do leite e seus derivados, principalmente no leite cru, considerando a resistência do microrganismo aos tratamentos térmicos aplicados na indústria, além da existência de estirpes psicrotróficas, capazes de se multiplicar durante o transporte e armazenamento dos produtos lácteos. A implementação de práticas adequadas para o manejo do rebanho e de higiene desde a produção são fatores importantes para a prevenção de contaminações microbianas do leite e seus derivados.

 

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