USO DE ANTIBIÓTICOS EM DILUENTE DE REFRIGERAÇÃO: GENTAMICINA OU CEFTIOFUR?

 

Na suinocultura tecnificada, a produção de doses inseminantes a partir da utilização de diluentes para conservação das células espermáticas à temperaturas de 15-17 ºC, possibilita a manutenção da capacidade fertilizante dos espermatozoides por curto período, de em média três à cinco dias (REED, 1990). Os diluidores para refrigeração contém componentes que proporcionam fonte de energia, tampão de pH, pressão osmótica apropriada, auxiliam na proteção do espermatozoide contra choque térmico e controlam o crescimento bacteriano (MEDRANO et al., 2005; GOGOL et al.,2009). A contaminação bacteriana é um fator intrínseco da preparação de uma dose de sêmen refrigerado de suíno para a inseminação artificial (IA) (ALTHOUSE; LU, 2005; ALTHOUSE, 2008; BUSSALEU et al., 2011). Os contaminantes biológicos atuam diretamente sobre a célula espermática, exercendo um efeito espermicida (ALTHOUSE; LU, 2005), o qual, parece ser dependente da quantidade de microrganismos presentes na dose, afetando tanto a concentração de células viáveis (integridade das membranas espermáticas) (ALTHOUSE et al., 2000) quanto a longevidade (ALTHOUSE et al., 2000; BUSSALLEU et al., 2011). Os antibióticos presentes nos diluidores de refrigeração seminal limitam a ação de microrganismos que causam alterações deletérias ao espermatozoide, sendo que atualmente, a gentamicina é o antibiótico mais comumente utilizado (ALTHOUSE; LU, 2005). O presente trabalho objetivou verificar o efeito dos antibióticos gentamicina e ceftiofur adicionados ao diluidor BTS (Beltsville Thawing Solution) de curta duração sobre as características de integridade de membranas dos espermatozoides suínos nas doses inseminantes armazenadas refrigeradas entre 15-17ºC por até 48 horas.

 

Cinco ejaculados foram obtidos de cada um dos cinco cachaços (n = cinco; r = cinco) de linhagem híbrida, sexualmente maduros. As amostras de sêmen foram coletadas em intervalo semanal pelo método da mão enluvada e filtradas para remoção da fração gelatinosa. Apenas ejaculados com motilidade ≥ 80% e defeitos morfológicos ≤ 10%, foram analisados. Para preparação das amostras, o ejaculado foi dividido em três alíquotas e diluídas (60 x 106 espermatozoides x ml) em BTS de curta duração com os três tratamentos: ceftiofur (CEFT), gentamicina (GENT) e sem antibiótico (SATB). As amostras foram armazenadas refrigeradas entre 15 a 17ºC e a integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial foram analisadas após 0h (90 minutos após o processamento da amostra), 24h e 48h. Em cada tempo de análise, uma alíquota de 150 μl de cada tratamento foram coradas com a associação de sondas fluorescentes de 0,5 μl de Hoescht 33342 (2,5mg/ml; Molecular Probes, H1399), 2μl de JC-1 (306μM; Molecular Probes, T3168), 3μl de PI (0,5 mg/ml; Sigma, 28,707-5) e 50μl de FITC-PSA (100μg/ml; Sigma, L0770), após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, as amostras foram avaliadas por microscopia de epifluorescência (Nikon, modelo Eclipse NI-U) e classificadas segundo Celeghini et al. (2007) e De Andrade et al. (2007). Os resultados obtidos foram analisados através de contrastes ortogonais (C1- CEFT vs. GENT; C2- GENT + CEFT vs. SATB) através do pacote computacional SAS.

 

A partir dos dados analisados, não foi possível observar (p > 0,05) interação entre os tratamentos e o tempo, com isso, os efeitos principais de tempo e tratamento foram estudados em separado. A utilização de gentamicina no diluente de refrigeração é capaz de melhorar (p < 0,05) a integridade da membrana plasmática, bem como o potencial de membrana mitocondrial, quando comparado com a utilização de ceftiofur. A utilização de antibióticos no meio de refrigeração do sêmen suíno, independente do principio ativo (gentamicina ou ceftiofur) melhora (p < 0,05) a integridade de membrana plasmática. Por outro lado, a utilização do diluidor sem antibiótico, não interferiu na porcentagem das células com membrana plasmática íntegra, membrana acrossomal íntegra e com alto potencial mitocondrial (IMIAHP), o que indica que a categoria de células desejadas em uma dose inseminante, não variou em função do antibiótico adicionado ao diluidor. As primeiras 24 horas de incubação, a partir de nossos resultados, podem ser consideradas as mais deletérias a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, uma vez que a redução (p < 0,05) da integridade das membranas foi observada nas primeiras 24 horas, mantendo-se estável (p > 0,05) após esse período (Figura 1).

 

Tabela 1 - Médias e ± erro padrão da média das características de integridade de membrana.

C1(Contraste 1) = CEFT vs. GENT; C2 (Contraste 2) = CEFT + GENT vs. SATB; T*T- interação tratamento e tempo.
IMIAHP- Categoria de células com membrana plasmática íntegra, membrana acrossomal íntegra e com alto potencial mitocondrial; IM- membrana plasmática íntegra; IA- membrana acrossomal íntegra; HP- ato potencial mitocondrial. (p< 0,05).

 

IMIAHP- Categoria de células com membrana plasmática íntegra, membrana acrossomal íntegra e com alto potencial mitocondrial; IM- membrana plasmática íntegra; IA- membrana acrossomal íntegra; HP- ato potencial mitocondrial.

Figura 1 - Médias e ± erro padrão da média das características de integridade de membrana em relação tempo de refrigeração a 15-17ºC.

 

Apesar da população de células desejáveis não ter diferido estatisticamente entre os tratamentos, a adição de antibiótico ao meio diluidor foi importante por influenciar a qualidade da membrana plasmática e do potencial mitocondrial dos espermatozoides suínos. Além disso, o uso de antibióticos nos diluentes de refrigeração garantem o controle da contaminação bacteriana proveniente da coleta, processamento e envase do sêmen.

 

À IVP Tecnologia do Brasil® e ao professor Dr. André Furugen Cesar de Andrade pela orientação.

 

1. ALTHOUSE, G. C.; KUSTER, C. E.; CLARK, S. G.; WEISIGER R. M. Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen. Theriogenology, n. 53, p. 1167 – 1176, 2000.

2. ALTHOUSE, G. C.; LU, K. G. Bacteriospermia in extended porcine semen. Theriogenology. v. 63, p.573–84, 2005.

3. ALTHOUSE, G. C. Sanitary procedures for the production of extended semen. Redroduction in Domestic Animals. n. 43 (suppl. 2), p. 374 – 378, 2008.

4. BUSSALLEU, E.; PINART, E.; YESTE, M.; BRIZ, S.; TORNER, E.; BONET, A. S. Pcr technique to detect enterotoxigenic and verotoxigenic Echerichia coli in boar semen samples. Research in Veterinary Science. v. 93, n.1, p.31-33, 2012.

5. CELEGHINI, E. C. C.; DE ARRUDA, R. P.; DE ANDRADE, A. F. C.; NASCIMENTO, J.; RAPHAEL, C. F. Practical techniques for bovine sperm simultaneous fluorimetric assessment of plasma, acrosomal and mitochondrial Membranes. Reproduction in Domestic Animals. V. 42, p. 479-488, 2007. 

6. DE ANDRADE, A. F. C.; DE ARRUDA, R. P.; CELEGHINI, E. C. C.; NASCIMENTO, J.; MARTINS, S. M. M. K.; RAPHAEL, C. F.; MORETTI, A. S. Fluorescent stain method for the simultaneous determination of mitochondrial potential and integrity of plasma and acrosomal membranes in boar sperm. Reproduction in Domestic Animals. n. 42, p. 190-194, 2007.

7. GOGOL, P.; SZCZESNIAK-FABIANCZYK, B.; WIERZCHOS-HILCZER, A. The photon emission, ATP level and motility of boar spermatozoa during liquid storage. Reproduction Biology. v. 9, p39– 49, 2009.

8. MEDRANO, A.; PEÑA, A.; RIGAU, T.; RODRÍGUEZ-GIL, J. E. Variations in the proportion of glycolytic/non-glycolytic energy substrates modulate sperm membrane integrity and function in diluted boar samples stored at 15-17 ºC. Reproduction in Domestic Animals. v. 40, p.445–53, 2005.

9. REED, H. C. B. Commercial requirements for an effective fresh semen diluent. In:Proceedings of the Second International Conference on Boar Semen Preservation. p.255–70, 1990.