Caracterização eletroforética de proteínas e estabilidade do leite em vacas submetidas à restrição alimentar

As empresas de laticínio buscam leite cru com elevada qualidade e adequada estabilidade térmica. No entanto, a baixa estabilidade térmica do leite, estimada pelo teste do álcool, é um problema grave e frequente, encontrado em vários estados do Brasil (Marques et al., 2007; Zanela et al., 2009; Oliveira et al., 2011). A ocorrência de leite instável nas unidades de produção leiteira tem gerado descarte de matéria prima passível de ser industrializada, e atritos entre produtores de leite e indústria. Os produtores comumente não compreendem o que reduz a estabilidade do leite e, equivocadamente, a associam apenas à acidez excessiva (Marques et al., 2007).

Restrição alimentar e desequilíbrios nutricionais, frequentemente observados em rebanhos bovinos comerciais (Carvalho et al., 2006), reduzem a produção leiteira, os percentuais de proteína e caseína (O'Brien et al., 1999; Guinard-Flamend et al., 2007), a estabilidade do leite no teste do álcool (Zanela et al., 2006), e podem diminuir a acidez (Zanela et al., 2006; Marques et al., 2010) e reduzir (Marques et al., 2010) ou não afetar (Zanela et al., 2006) a densidade. O incremento do aporte nutricional, no entanto, aumenta a produção leiteira, os percentuais de proteína, lactose e caseína (O'Brien et al., 1999) e a estabilidade do leite, em vacas em estádio inicial ou médio de lactação (Marques et al., 2010).

Diferenças na estabilidade do leite, todavia, têm sido observadas em animais submetidos à restrição alimentar (Zanela et al., 2006). Essas diferenças podem estar relacionadas à composição da fração proteica do leite. Apesar disso, um limitado número de estudos tem averiguado a possível influência de proteínas do leite sobre sua estabilidade. Contudo, nem a correlação entre aporte alimentar e alteração no conteúdo de proteínas solúveis e insolúveis do leite, nem sua relação com a estabilidade do leite foram estudadas até o momento.

A proporção de κ-caseína (Robitaille et al., 2001) e o polimorfismo genético das proteínas (Paterson et al., 1999) têm sido associados à estabilidade do leite. Michalcová & Kruporá (2007) verificaram efeito negativo do alelo B na combinação fenotípica κ-caseína e β-lactoglobulina sobre a estabilidade no teste do álcool, ao contrário de Lopes (2008), que não encontrou diferenças nas frações proteicas entre o leite estável e instável, pelo teste do álcool, e de Botaro et al. (2007, 2009), que não observaram diferenças entre o leite instável e estável quanto ao polimorfismo da β-lactoglobulina e da κ-caseína. A contradição dos resultados quanto à composição das proteínas do leite e sua estabilidade, e o pequeno número de estudos que relacionam a variação do aporte alimentar com o conteúdo de proteínas solúveis e insolúveis no leite motivaram a realização do presente trabalho.

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da restrição alimentar sobre a produção de leite bovino e sobre seu perfil eletroforético de proteínas, bem como relacioná-los à estabilidade do leite no teste do álcool.

 

Os animais foram selecionados do rebanho leiteiro do Sistema de Desenvolvimento e Pecuária Leiteira (Sispel), da Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS. Foram realizados dois experimentos: no primeiro, avaliou-se o efeito da redução de 40% da alimentação, fornecida no cocho a vacas semiconfinadas; no segundo, avaliou-se o efeito da redução de 30% de nutrientes digestíveis totais, em vacas confinadas.

No primeiro experimento, de abril a agosto de 2008, foram utilizadas seis vacas semiconfinadas da raça Jersey, em delineamento reversível, e cada vaca foi considerada uma unidade experimental. Ao início do estudo, as vacas produziam média diária de 16,4±3,2 L de leite, encontravam-se com 48,3±30,4 dias de lactação, pesavam 382,4±15,39 kg e apresentavam 2,6±0,33 de escore de condição corporal (escala 1–5).

Durante o período pré-experimental de 15 dias, as vacas receberam 6,44 kg de ração concentrada e 4 kg de feno de alfafa por animal por dia, em dois arraçoamentos, além de sal mineral à vontade em cocho separado. A composição média do concentrado da dieta, nesse período foi de: sorgo em grão, 543 g kg^-1; milho em grão, 177 g kg^-1; farelo de soja 264 g kg^-1; e 1,6 g kg^-1 de fosfato bicálcico. Após a ordenha da manhã, todos os animais foram mantidos em pastagem de azevém anual (Lolium multiflorum) e aveia (Avena strigosa).

Durante o período experimental de 120 dias, as vacas receberam, alternadamente, a cada 30 dias, dieta controle, formulada para atender às exigências nutricionais de vacas com aproximadamente 400 kg, para produção diária de 20 L de leite com 50 g kg^-1 de gordura (National Research Council, 2001); e dieta de restrição, constituída por 60% da alimentação fornecida no cocho, relativa à dieta controle. A dieta controle consistiu de: 412 g kg^-1 de sorgo em grão; 470 g kg^-1 de casca de soja; 103 g kg^-1 de farelo de soja; e 15 g kg^-1de fosfato bicálcico. Foram fornecidos 6,44 kg de ração concentrada e 4 kg de feno de alfafa por animal, por dia, divididos em duas vezes, além de sal mineral à vontade em cocho separado. Entre os arraçoamentos, as vacas foram mantidas juntas, em pastagem natural melhorada com sobressemeadura de aveia e azevém anual. As vacas foram divididas em dois grupos que, alternadamente, receberam as dietas: o grupo um, iniciou com a dieta controle; e o grupo dois, com a dieta de restrição (Tabela 1).

 

No segundo experimento, realizado de abril a maio de 2010, foram utilizadas 16 vacas da raça Jersey, confinadas em instalações tipo "free-stall", em delineamento inteiramente casualizado, em que as vacas receberam a dieta controle ou a dieta ajustada em 30% da quantidade de nutrientes digestíveis totais. Cada vaca foi considerada uma unidade experimental. Ao início do experimento, as vacas estavam, em média, com 210 dias de lactação, produziam 12±2,30 L de leite e pesavam 420±62,4 kg de peso corporal.

Os períodos experimentais foram de 14 dias cada, tendo sido um pré-experimental e dois experimentais, o que resultou no total de 42 dias. No período pré-experimental, a dieta basal diária, fornecida a cada vaca, constituiu-se de 5 kg de ração concentrada, 30 kg de silagem de sorgo e 1,5 kg de feno de alfafa. O concentrado fornecido continha 380 g kg^-1 de soja em grão, 200 g kg^-1 de milho em grão, 380 g kg^-1 de farelo de arroz integral, 20 g kg^-1 de mistura mineral-vitamínica, 8 g kg^-1 de calcário calcítico e 12 g kg^-1 de NaCl (Tabela 2). O ajuste da dieta foi realizado para atender às exigências nutricionais de vacas com 420 kg de peso vivo, com produção média diária de 12 L de leite com 60 g kg^-1 de gordura, sem ganho de peso, e com 33 semanas de lactação (National Research Council, 2001). O fornecimento da dieta foi realizado após as ordenhas da manhã e da tarde.

 

No início e no final de cada período experimental, foram registrados o peso e o estado de condição corporal, além da produção de leite, e foram coletadas amostras de leite nas ordenhas da manhã e a tarde, que foram mantidas resfriadas e, posteriormente, misturadas à produção leiteira, para formar uma amostra composta por animal. Foram determinados: a estabilidade do leite no teste do álcool, com concentrações de etanol na solução alcoólica de 68º até 80ºGL (Zanela et al., 2006); o pH; e a acidez titulável (Tronco, 1997). Uma alíquota das amostras de leite foi utilizada para a determinação da composição da fração proteica por eletroforese.

As amostras de leite compostas, destinadas à eletroforese, foram congeladas e mantidas em freezer a -20°C até o momento da realização da análise. Na preparação das amostras, o leite foi descongelado lentamente, a 8ºC, e desnatado por centrifugação a 2.100 g por 30 min a 32°C. Posteriormente, as amostras foram liofilizadas e acondicionadas em freezer a -20ºC, até o momento da realização da eletroforese (Egito et al., 2006). Para a avaliação do perfil eletroforético das proteínas, utilizou-se uma cuba para eletroforese vertical Hoefer SE 600 standard dual cooled (Amersham Pharmacia Biotech). A SDS-page foi realizada com géis à concentração de 4,9%, em 125 mmol L-1 de tampão Tris-HCl, pH 6,8, e com géis de separação com 15,4% de poliacrilamida, em 380 mmol L-1 de tampão Tris-HCl, pH 8,8, com 0,1% de SDS. As amostras (2 mg mL-1) foram dissolvidas em tampão Tris-HCl, pH 6,8, com 0,1% de SDS e 5% de β-mercaptoetanol. Em seguida, foram aquecidas a 100°C por 3 min, e 20 μL foram depositados nos géis (Egito et al., 2006).

Após a corrida, as proteínas foram fixadas no gel com 12% de ácido tricloroacético (TCA) durante 30 min e, em seguida, coradas com 0,1% de azul de Coomassie R250, dissolvido em uma mistura de 50% de etanol e 2% de TCA, durante 120 min. A descoloração foi realizada durante uma noite, com uma solução a 30% de etanol e 7,5% de ácido acético (Egito et al., 2006). Os géis foram escaneados e processados por análise de imagens (Gel-Pro Analyser, Versão 6.0, Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA.), para quantificar a densidade óptica de cada fração proteica. O resultado da percentagem de cada faixa de eletroforese (fração proteica) foi calculado com base em 100% da densidade óptica do total da corrida, tendo-se descontado o background (fundo sem coloração) na coluna. Foi utilizado o marcador de peso molecular padrão (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), para identificar o peso molecular das frações de proteínas que continham miosina (200,0 kDa), β-galactosidase (116,2 kDa), fosforilase b (97,4 kDa), soro albumina bovina (66,2 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), anidrase carbônica (31,0 kDa), inibidor de tripsina (21,5 kDa), lisozima (14,5 kDa), e aprotinina (6,5 kDa). As bandas identificadas, selecionadas e quantificadas das proteínas do leite, obtidas por densitometria, foram: lactoferrina; albumina sérica bovina; imunoglobulina sérica de cadeia pesada; frações de caseína (CN) αS-CN: αS1 + αS2, β-CN, κ-CN; e as proteínas solúveis β-lactoglobulina e α-lactoalbumina. Os valores de proteína total e da caseína total foram calculados, respectivamente, como o somatório do resultado da densitometria das proteínas solúveis e insolúveis, e apenas das caseínas.

A análise estatística do primeiro experimento considerou o delineamento reversível com dois grupos, tendo-se avaliado os efeitos de dieta (controle e restrição, n = 2) e período (n = 4). Os dados foram submetidos à análise de variância, e a comparação de médias foi feita pelo DMS de Fischer a 5% de probabilidade, pelos procedimentos GLM e LSMeans, e a associação entre as variáveis foi feita pela correlação linear com o coeficiente de Pearson, pelo procedimento Corr (SAS Institute, 1999).

Na análise estatística do segundo experimento, considerou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, tendo-se avaliado o efeito dieta (controle e restrição, n = 2). O teste de médias utilizado foi o t-pareado, com o procedimento t-test, e a associação entre as variáveis foi feita pela correlação linear, com o coeficiente de Pearson determinado pelo procedimento Corr.

Adicionalmente, analisou-se a composição proteica do leite conforme sua estabilidade no teste do álcool. Considerou-se, separadamente, cada experimento, tendo as amostras de leite sido classificadas como instáveis, quando coagularam no teste do álcool em concentrações de etanol menores ou iguais a 72°GL; as demais amostras foram consideradas estáveis. Os dados de composição proteica foram submetidos à análise de variância, em delineamento inteiramente casualizado, tendo-se considerado o efeito de estabilidade (leite estável e leite instável, n = 2).

 

A restrição de 40% da alimentação fornecida no cocho a vacas semiconfinadas reduziu a produção leiteira em 15,5%, mas não alterou características físicas como pH, acidez titulável e estabilidade do leite no teste do álcool, nem a composição proteica do leite (Tabela 3). A concentração mínima de etanol que provocou coagulação das caseínas, no teste do álcool, foi inversamente relacionada à concentração de β-caseína (r = -0,50, p<0,05, n = 24) e ao teor de proteína total do leite (r = -0,45, p<0,05, n = 24). As amostras de leite instáveis apresentaram maiores concentrações de β-caseína e de proteína total, mas menores valores de κ-caseína, comparadas ao leite estável (Tabela 4).

A restrição de 30% do aporte energético a vacas confinadas reduziu o pH, a estabilidade do leite no teste do álcool e a proporção de albumina sérica bovina, mas não alterou a produção e as demais frações proteicas do leite (Tabela 5). A concentração mínima de etanol capaz de causar a coagulação das caseínas no teste do álcool não foi correlacionada a qualquer das frações proteicas. Não houve diferenças entre as amostras de leite instável e estável, quanto à proporção das frações proteicas.

A redução da produção leiteira, em consequência da restrição de 40% na alimentação, em vacas semiconfinadas, está relacionada ao menor aporte nutricional; todavia, sua magnitude apenas moderada pode ser explicada, em parte, por um provável consumo compensatório de pasto, embora não se tenha avaliado isto. Essa inferência encontra suporte na redução apenas moderada na produção leiteira (15,5%), na ausência de efeito da restrição alimentar sobre o peso corporal – respectivamente de 388,6 e 386,5 kg, para as dietas controle e restrição –, e o estado de condição corporal – respectivamente de 2,33 e 2,45. Esse resultado está de acordo com Guinard-Flamend et al. (2007), que reportaram que restrições de 20 a 40% na alimentação fornecida reduziram a produção leiteira entre 15 e 25%. Contudo, em estudos com vacas submetidas a 40 e 50% de restrição alimentar, a magnitude da redução da produção leiteira foi maior (Zanela et al., 2006; Fruscalso, 2007), o que pode estar relacionado ao estádio lactacional mais precoce, à menor condição corporal e à impossibilidade de consumo compensatório da pastagem, nesses estudos.

A restrição de 30% do aporte energético em vacas confinadas, no entanto, não reduziu sua produção leiteira, o que pode estar relacionado a seu avançado estádio lactacional, já que essas vacas se encontravam com mais de 230 dias de lactação. Isso pode ter causado diminuição na capacidade de resposta das vacas à alimentação, pela redução no número de células epiteliais mamárias e pelo aumento da taxa de apoptose (Capuco et al., 2001), observada em vacas sob restrição alimentar (Dessauge et al., 2011).

A restrição de 40% na alimentação fornecida a vacas semiconfinadas não teve efeito sobre a estabilidade do leite no teste do álcool (Tabela 3), o que discorda dos resultados obtidos pela restrição de 30% no aporte energético a vacas confinadas, observados no presente trabalho (Tabela 4). Tal resultado discorda, também, dos de Hernández & Ponce (2006), Zanela et al. (2006) e Fruscalso (2007).

A relação entre restrição alimentar e redução da estabilidade do leite ainda não foi completamente explicada; porém, há evidência de que o estresse causado pela restrição pode provocar aumento da permeabilidade das junções firmes entre as células epiteliais mamárias e, com isso, a maior passagem de cátions monovalentes provenientes do sangue, o que aumentaria a força iônica e diminuiria a repulsão entre as micelas, o que teria efeito favorável à coagulação (Stumpf, 2012).

No presente trabalho, a restrição alimentar não alterou o perfil eletroforético das proteínas do leite, exceto pela redução observada na albumina sérica bovina. O incremento da albumina sérica bovina é usualmente associado ao aumento da permeabilidade dos capilares ou das junções das células epiteliais mamárias, provocados por prolongamento do intervalo entre ordenhas (Bernier-Dodier et al., 2010) e por inflamação ou infecção do úbere (Litwinczuk et al., 2011). Entretanto, no presente trabalho, não houve diferença quanto à contagem de células somáticas, em leite de vacas confinadas que receberam a dieta controle e a dieta com restrição de 30% no aporte energético, respectivamente de 5,49±0,68 e 5,31±0,56 células.

Guinard-Flamend et al. (2007) observaram que restrição alimentar de 30% reduziu o percentual de caseína, mas não alterou o percentual de soro-proteínas lácteas. Dessauge et al. (2011) observaram menor expressão da transcrição de α-lactoalbumina e κ-caseína, em vacas submetidas à restrição alimentar.

Quanto à composição proteica do leite, os resultados estão de acordo com os de Fruscalso (2007), em que a restrição alimentar não causou alteração no teor de proteína do leite; porém, diferem de dados relativos à redução no teor de proteína total, provocada por restrição na alimentação oferecida (O'Brien et al., 1999; Zanela et al., 2006; Guinard-Flamend et al., 2007), e de dados relativos à proteína metabolizável na dieta (Hernández & Ponce, 2006), ou ao aumento no teor de proteína total observado com o maior aporte de nutrientes na dieta (Marques et al., 2010).

Bartsch et al. (1979) verificaram que a proporção das frações β-lactoglobulina e α-lactoalbumina, em relação à proteína total, não se alteraram e tampouco mostraram relação com a estabilidade térmica do leite, dados corroborados pelo presente trabalho. A ausência de efeito da restrição alimentar sobre o percentual de proteína total do leite, verificada no presente trabalho, corrobora também os resultados de Fruscalso (2007). Porém, discorda dos resultados de O'Brien et al. (1999), Zanela et al. (2006) e Guinard-Flamend et al. (2007), que encontraram redução no teor de proteína total no leite, após submeterem vacas à restrição da quantidade de alimentos ou de proteína metabolizável na dieta (Hernández & Ponce, 2006). Além disso, Marques et al. (2010) verificaram aumento no teor de proteína total no leite, ao fornecer maior aporte de nutrientes na dieta. O'Brien et al. (1999) observaram que a oferta reduzida de pasto reduziu a estabilidade do leite no teste do álcool, e os teores de proteína total e de caseína. Esses autores também verificaram aumento de plasmina, uma protease que degrada especialmente a β-caseína, no leite de vacas mantidas sob oferta reduzida de pasto.

A relação negativa encontrada entre β-caseína e estabilidade do leite no teste do álcool, e o maior percentual dessa proteína no leite instável (Tabela 4) contradizem os resultados de Silanikove et al. (2000, 2009). Segundo esses autores, a β-caseína é degradada pela plasmina, em condições de estresse ou restrição alimentar (O'Brien et al., 1999), o que gera o peptídeo 1-28 (γ-caseína) que, por sua vez, bloqueia os canais de potássio junto à membrana apical das células epiteliais mamárias e reduz a síntese do leite e de seus componentes.

Além disso, a maior concentração da κ-caseína no leite estável está em concordância com os resultados de Robitaille et al. (2001). Fox & Brodkorb (2008) destacam a ação estabilizante da kappa-caseína, ao realizar a interface entre o interior da micela, onde se concentram as caseínas mais hidrofóbicas, e o ambiente aquoso, o que atua como uma barreira física e eletrostática à agregação. Entretanto, o resultado deste trabalho discorda dos descritos por Botaro et al. (2007) e Lopes (2008), que não verificaram diferenças no percentual de κ-caseína entre leite estável e instável.

 

1. A restrição de 40% na alimentação reduz a estabilidade do leite e a produção leiteira, mas não altera a composição da fração proteica do leite.

2. Amostras de leite instáveis ao teste do álcool apresentam menor concentração de κ-caseína e maiores concentrações de β-caseína e de proteínas totais.

3. A restrição de 30% do aporte energético a vacas confinadas e em estádio avançado de lactação não reduz a produção leiteira, porém diminuiu a percentagem de albumina sérica bovina e a estabilidade do leite; neste caso, o leite instável e o estável não diferem quanto à proporção das frações protéicas.

 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, por concessão de bolsa.

 

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