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Caracterização de um rebanho Gir Leiteiro quanto à origem do DNA Mitocondrial (mtDNA)

Publicado: 15 de abril de 2013
Por: Anibal Eugênio Vercesi Filho do Polo Regional de Desenvolvimento Tecnológico dos Agronegócios do Nordeste Paulista -PRDTA-, Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios -APTA-, SP; André Lima Dias da Prefeitura Municipal de Mococa, SP; Vera Lúcia Cardoso e Lenira El Faro do PRDTA do Centro Leste, APTA, SP, e Giovana Krempel Fonseca Meringues e Flávio Vieira Meirelles do Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos -FZEA-, Universidade de São Paulo -USP-, SP.
Sumário

RESUMO: As raças zebuínas entraram no Brasil principalmente no século passado através de importações do continente indiano. Com a chegada do gado zebu, o rebanho nacional sofreu profunda modificação pelo processo de cruzamento absorvente e foi sendo gradativamente "azebuado" com a utilização de touros das raças zebuínas. Com isso, criou-se um polimorfismo quanto à origem do DNA mitocondrial (mtDNA) nos animais zebuínos visto grande parte serem oriundos de cruzamentos absorventes a partir de vacas taurinas. Para verificação da origem materna das matrizes do rebanho Gir Leiteiro da APTA, Mococa foram analisadas 60 fêmeas sendo que, 33 apresentaram mtDNA de origem Bos taurus enquanto 27 apresentaram mtDNA de origem Bos indicus . Nenhum animal apresentou os dois genótipos, comprovando assim a ausência de heteroplasmia para este marcador.

Palavras Chave: mtDNA, Gir Leiteiro, bovinos

INTRODUÇÃO
No Brasil, o rebanho bovino foi formado originalmente pelo gado de origem taurina trazido da Península Ibérica na época da colonização. Com a entrada do gado zebuíno, grande parte do rebanho nacional passou por um processo de substituição através de cruzamentos absorventes com touros zebuínos (SANTIAGO, 1986). Diferentemente do DNA nuclear, o mtDNA é herdado de maneira quase exclusiva pela linhagem materna em mamíferos (GILES et al, 1980); e como a maioria dos animais zebuínos trazidos nas importações eram machos (MAGNABOSCO, 1997), os produtos resultantes do processo de cruzamentos absorventes por touros zebuínos nas vacas de origem taurina nacional conservaram ao longo do tempo e com o passar das gerações o mtDNA de origem taurina. Este processo foi confirmado por MEIRELLES et al (1999) que identificaram 79; 73 e 100% dos animais analisados das raças Nelore, Gir e Brahman puros de origem, respectivamente, como portadores de mtDNA de origem Bos taurus.
O DNA mitocondrial (mtDNA) está localizado na membrana interna da mitocôndria, organela presente no citoplasma das células eucariotas, cuja principal função é a fosforilação oxidativa. O estudo do mtDNA, por ser este transmitido apenas através da linhagem materna, permite distinguir a origem da linhagem.
Vários trabalhos têm sido realizados em populações bovinas de leite e corte procurando evidenciar a herança mitocondrial como fonte de variação genética para características de importância econômica, porém os resultados ainda são controversos. Enquanto alguns autores encontraram influência significativa da herança mitocondrial (ROUGHSEDGE et al, 1999, SCHNITZENLEHNER e ESSL, 1999), outros concluíram que este efeito é negligenciável (ALBUQUERQUE et al, 1998, RORATO et al, 1999, MEZZADRA et al, 2005).
A raça Gir entrou no Brasil provavelmente no ano de 1906, porém as importações mais importantes aconteceram em 1930, 1960 e 1962 com grande contribuição para a formação do pool gênico da raça nos dias atuais. A raça é nativa da Índia onde é explorada para leite e é predominante na região da península de Kathiawar (SANTIAGO, 1986). No Brasil a raça foi utilizada inicialmente para corte, porém a seleção visando à produção de leite foi iniciada já na década de 1930. Nos dias atuais, a raça Gir é utilizada principalmente para produção de leite, embora haja um grupo de criadores que a utilizem também para produção de carne.
O rebanho Gir Leiteiro da Estação Experimental de Zootecnia de Ribeirão Preto, do Instituto de Zootecnia (atual Polo Regional Centro Leste) foi formado no início da década de 1960 por 50 matrizes registradas e pelo reprodutor Xopotó, oriundo do rebanho da Fazenda Experimental Getúlio Vargas (EPAMIG). Este rebanho foi mantido sob seleção leiteira no referido Polo até 1998, quando foi deslocado para o Polo de Pindamonhangaba e o programa de seleção interrompido. A partir do ano de 2006 o rebanho foi transferido para o Polo Regional do Nordeste Paulista, APTA, Mococa, SP, onde está sendo reestruturado visando a retomada do programa de melhoramento genético para fins de produção de leite.
O objetivo deste trabalho foi analisar a origem materna de matrizes Gir Leiteiro pertencentes ao rebanho leiteiro do Polo Regional do Nordeste Paulista, APTA, SP.
 
MATERIAL E MÉTODOS
Extração do DNA
Foram utilizadas 60 fêmeas da raça Gir Leiteiro pertencentes ao rebanho da APTA, Mococa. Foram coletados 5 mL de sangue periférico em tubos a vácuo, contendo 54 μL de EDTA e mantidos sob refrigeração até serem processados. A extração do DNA foi realizada a partir de 1 mL de sangue como descrito por SAMBROOK e RUSSEL (2001). As hemácias foram lisadas com uma solução de Lise de Hemácias (12mMTris-HCL pH 8.2; 0,32M Sacarose; 5mM EDTA e 1% de Triton 100X) e os glóbulos brancos foram digeridos com proteinase K por 3 horas. As proteínas foram então precipitadas com solução de NaCl 5M e o sobrenadante transferido para outro tubo. O DNA total foi precipitado com adição de 3 volumes de etanol absoluto, desidratado e rediluído em 50 μL de H2O ultrafiltrada.
DNA Mitocondrial (mtDNA)
A amplificação do mtDNA foi realizada utilizando- se os primers BosmtF1 5´- cccaacgaggaaaatatacc- 3´ e BosmtR1 5´-aaccgcaaacaacctcttcc-3´, sintetizados para amplificar uma região do gene ND5 do genoma mitocondrial dos nucleotídeos 11.770 ao 12.525 de acordo com ANDERSON et al (1982). Para a reação de PCR utilizaram-se 100ng de DNA para uma reação de 50μL, em condições de tampão determinadas pelo fabricante, 200 μM de dATP; dTTP; dCTP; Dgtp; 1,25U de Taq DNA polimerase e 0,2μM de cada oligonucleotídeo iniciador (primer) em 35 ciclos de 30 segundos à 94ºC, 45 segundos à 58 ºC e 45 segundos à 72 ºC. O mtDNA amplificado foi então digerido com a enzima de restrição Hind III, corado com Brometo de etídeo e submetido à eletroforese em gel de agarose 1,5% em TBE 1X.
O mtDNA foi analisado e, de acordo com a presença ou ausência do sítio de restrição da enzima Hind III, os indivíduos foram classificados como portadores de mtDNA de B. taurus ou portadores de mtDNA de B. indicus.
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Do total de 60 fêmeas analisadas, 33 (55%) apresentaram mtDNA de origem Bos taurus enquanto 27 (45%) apresentaram mtDNA de origem Bos indicus . Nenhum animal apresentou os dois genótipos, comprovando assim a ausência de heteroplasmia para este marcador no rebanho estudado.
Na Figura 1 são mostrados os fragmentos de DNA mitocondrial amplificados por PCR e digeridos com a enzima de restrição Hind III, corados com brometo de etídeo e vizualizados em gel de agarose 1,5 de animais com mtDNA Bos indicus e com mtDNA Bos taurus.
Figura 1. Fragmentos de DNA mitocondrial amplificados por PCR e digeridos com a enzima de restrição Hind III, corados com brometo de etídeo e vizualizados em gel de agarose 1,5%. As duas primeiras linhas mostram mtDNA amplificado de animais previamente conhecidos; linhas 1, 2, 3 e 5 mostram animais com mtDNA Bos indicus; linhas 4 e 6 mostram animais com mtDNA Bos taurus
Caracterização de um rebanho Gir Leiteiro quanto à origem do DNA Mitocondrial (mtDNA) - Image 1
A presença de 55% de matrizes com mtDNA de origem taurina corrobora com a hipótese do rebanho zebuíno nacional ter sido formado principalmente através do cruzamento absorvente de touros zebus em fêmeas de origem taurina. MEIRELLES et al. (1999) apresentaram resultados semelhantes, encontrando, em média, 58% de animais das raças Gir e Nelore com mtDNA de origem taurina. No referido trabalho, os autores relataram ainda que 25% dos animais POI (puros de origem importada) de ambas as raças também apresentaram mtDNA de origem taurina, o que pode refletir erros de pedigree desses animais. Nos animais da raça Brahman (23 animais), os autores encontraram 100% dos animais com mtDNA de origem taurina e também reportaram a ausência de animais com os dois genótipos de mtDNA.
Vários estudos têm sido realizados no intuito de se verificar a existência de efeito da linhagem materna em características de importância econômica tanto em gado de leite quanto em gado de corte. Embora os resultados ainda sejam controversos, alguns achados são bastante interessantes. BOETTCHER et al (1996) concluíram que o efeito citoplasmático está mais associado com a composição do leite do que com o volume. Os autores argumentam que a gordura é o componente com maior densidade energética no leite e que praticamente toda energia proveniente dos alimentos é transformada em ATP nas mitocôndrias. Sendo assim, seria bastante racional se esperar uma relação mais forte entre gordura, energia do leite e mtDNA.
SCHULTZ et al (1993) agruparam vacas leiteiras da raça Holandesa em linhagens maternas de acordo com seqüências específicas de mtDNA e observaram que os grupos diferiram significativamente para produção e porcentagem de gordura e para a quantidade de energia estimada no leite.
BIASE et al, (2008) estudando polimorfismos no mtDNA em animais da raça Nelore, concluíram que os mesmos afetam características ponderais e que podem ser uma fonte de variação genética em características quantitativas. Os autores comentaram ainda que o efeito da variação do genoma do mtDNA na produção de leite e carne pode ser uma conseqüência de alterações de rotas metabólicas ou de energia disponível para produção de leite e desenvolvimento do tecido muscular.
 
CONCLUSÕES
Existe no rebanho Gir Leiteiro da APTA Mococa polimorfismo quanto à origem do mtDNA, sendo que 55% das matrizes são de origem Bos taurus, o que auxilia na comprovação da tese de que o rebanho zebuíno nacional têm na sua formação importante influência de cruzamentos absorventes de touros zebuínos em matrizes de origem taurina.
Estudos necessitam ser realizados para identificação de possível influência do mtDNA em características de produção de leite na raça Gir.
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBUQUERQUE, L.G.; KEOWN, J.F.; VAN VLECK, L.D. Variances of direct genetic effects, maternal genetic effects and cytoplasmatic inheritance effects for milk yield, fat yield and fat percentage. Journal of Dairy Science, v. 81, p. 554-549, 1998.
ANDERSON, S. et al. The complete sequence of bovine mitochondrial DNA: conserved features of the mitochondrial genome. Journal Molecular Biology, v. 156, p. 683-717, 1982.
BIASE, F.H. et al. Mitochondrial DNA single nucleotide polymorphism associated with weight estimated breeding values in Nelore cattle (Bos indicus). Genetics and Molecular Biology, v. 30, n.4, 2007. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext& pid=S1415-47572007000600005&lng=in&nrm=iso&tlng=in . Acesso em 15/09/2009.
BOETTCHER, P.J. et al. Multiple herd evaluation of effects of maternal lineage on yields traits of Holstein cattle. Journal of Dairy Science, v. 79, p. 655-662, 1996.
GILES, R.E. et al. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 77, p.6715- 6719, 1980.
MAGNABOSCO, A.U. et al. Catálogo de linhagens do germoplasma zebuíno: Raça Nelore. Cenargen, Brasília, p. 11-52, 1997.
MEIRELLES, F.V. et al. Is the american zebu really Bos indicus? Genetics and Molecular Biology, v. 22, n.4, p.543- 546, 1999.
MEZZADRA, C.A. et al. Effects of cytoplasmatic inheritance on preweaning traits of Hereford cattle. Genetics and Moecular Biology, v. 28, n.3, p.357-362, 2005.
RORATO, P.R. et al. Variance caused by citoplasmatic line and sire by herd interections effects for milk yield considering estimation bias. Journal of Dairy Science, v. 82, p.1574-1580, 1999.
ROUGHSEDGE, T. et al. Estimation of variance of maternal lineage effects at the Langhill dairy herd. Animal Science, v. 68, p.79-86, 1999.
SANTIAGO, A.A. O Zebu na Índia, no Brasil e no mundo. Campinas: Instituto Campineiro de Ensino Agrícola, 1986. 745p.
SCHNITZENLEHNER, S. and ESSL, A. Field data analysis of cytoplasmatic inheritance of dairy and fitness-related traits in cattle. Animal Science, v. 68, p. 459-466, 1999.
SCHUTZ, M.M.; et al. Effects of maternal lineages grouped by mitochondrial genotypes on milk yield and composition. Journal of Dairy Science, v. 76, p.621-629, 1993.

**O trabalho foi originalmente publicado no Boletim da Indústria Animal (BIA), do Instituto Zootecnia (IZ/APTA), da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do estado de São Paulo, Brasil. Dado bibliográfico : B. Indústr.anim., N. Odessa,v.67, n.1, p.91-95, 2010
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Autores:
Anibal Eugênio Vercesi Filho
APTA
Lenira El Faro Zadra
APTA
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Rinaldo Dos Santos
Editora Agropecuária Tropical
13 de mayo de 2013

Vivemos de 1978 a 1983 - cinco anos - analisando a sobrevivência dos animais na Grande Seca ("maldição dos 100 anos"). Ficou evidente a "rotina" de aniquilamento dos animais por redução filogenética. Os que apresentavam maior dissociação genética sucumbiram primeiro. A ordem foi a seguinte, conforme várias publicações na revista "Agropecuária Tropical" daqueles anos: 1) taurinos leiteiros diante da falta de alimentos; 2) taurinos de corte; 3) mestiços tauríndicos leiteiros; 4) mestiços tauríndicos de corte; 5) zebuínos com forte dissociação genética (várias "raças" no mesmo animal); 6) zebuínos com pouca variabilidade genética em seu patrimônio (guzonel, indunel, etc.); 7) zebuínos rigorosamente "puros" (Guzerá, etc.). Chegamos a ver uma fazenda com 1.000 vacas Nelore e todas estavam mortas, voltadas para o açude sem água. Quando morreu o primeiro Guzerá, a maior parte dos rebanhos já estava dizimada (1981 e 1982). Estranhamente, um mestiço de Gir com Nelore sobreviveu, orgulhosamente, enquanto todos seus contemporâneos morreram! Estas observações garantem que a seleção por Filogenia é necessária em regiões onde há possibilidade de grandes secas (ou frios). Quanto mais homogêneo for o patrimônio genético, mais adequado será o animal à equação do organismo adequado: "região + situação". O conceito de "raça", portanto, tem muito a ver com a dissociação genética do grupamento básico adequado a certa região (mais situação). Exemplo: um Gir Leiteiro fortemente taurinizado sucumbirá, no Semiárido brasileiro, mais rapidamente que um Gir Leiteiro fracamente taurinizado. Já um Gir Leiteiro "puro" dificilmente sucumbirá. Para analisar a sucumbência, existe a "redução filogenética", ou seja, o abandono deliberado ao sol, por gerações, para reduzir a influência tauríndica. Foi o que aconteceu com o "Anglo-Nubiano" que perdeu o "Anglo". É o que faz o Nelore Convernel, para obter animais "originais", ou seja, da origem. A redução filogenética é uma ferramenta para testar adequação a "n" climas, situações, regiões, etc. e deveria ser bastante utilizada. Muitos produtores de carne fazem a "redução filogenética", antes de utilizar os touros adquiridos, com sucesso. A sistematização da prática é o fundamento da Ciência! Rinaldo dos Santos (vide ZEBU: a Pecuária Sustentável, e outros livros que abordam a pecuária em regiões rústicas).

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Andre Oliveira
Provimi
12 de mayo de 2013
Caro Ivan: Esclarecedora a forma como abordou o conceito de "raça". Concordo plenamente consigo. Em Portugal o Clube Português de Canicultura patrocinou no fim a década de 90 um estudo de marcadores genéticos com o objetivo de diferenciar as 8 raças portuguesas e ajudar a tomar a decisão de considerar uma nova. O resultado foi de que, segundo a marcação genética, e apesar das 8 raças estarem perfeitamente definidas há 50 anos, as 8 raças teriam de se resumir a apenas 3. Este problema só foi resolvido com a análise biométrica, histórica e funcional. Ou seja, o fenótipo, a expressão dos genes num determinado ambiente durante anos e a sua consistente seleção e passagem às gerações futuras, com benefício para o Homem e animais envolvidos, é para mim, o conceito de raça. E diria mais: "raça não existe e no entanto é tudo o que queiramos que ela seja"; isto é, a raça de um qualquer animal doméstico não faz sentido (porque pressupõe um investimento de muitos anos e décadas) se não fôr para que o animal esteja servindo os interesses do Homem.
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Ivan Luz Ledic
6 de mayo de 2013

Ricardo Imbassahy, não só no Gir Leiteiro, mas em todos os Gir e na maioria dos Zebus. Inclusive muitos POI Nelre apresentam DNAs taurus conforme trabalho de tese da USP- Ribeirão Preto. Muitos animais adquiridos pelos importadores que foram à Índia eram animais de rua e que já haviam sofrido cruzamentos com outras raças. Se analisarmos que entraram somente cerca de 680 animais Gir nas importações da Índia até 1962 (e a maioria era machos), como é que já em 1973 tinham mais de 28 mil RGD? E isso sem FIV e TE. Em todas raças Zebus houve cruzamentos entre elas, o que se procura é registrar animais que enquadrem dentro do padrão especificado para manutenção daquilo que se chama raça, uma convenção.
Visando aclarar definições e buscar respostas do que são raças e pureza racial, consultamos a literatura onde geneticistas e biólogos discutem esse assunto. As divisões da taxonomia dos seres vivos tentam descrever através da filogenia o princípio darwiniano de ascendência comum, para se chegar até a espécie animal. Segundo a teoria da evolução, nas espécies sexuadas, um conjunto de indivíduos geneticamente idênticos, que poderiam ser considerados raças puras, não existem e nunca existiram.
Em uma espécie animal sempre ocorreu migração de genes por acasalamentos entre grupos, famílias e variedades em seu habitat natural. No passado, alguns grupamentos ou manadas, por isolamento geográfico e adaptação ao meio ambiente, desenvolveram aparência ou tipo definido, mas ainda assim com variação individual e com genes advindos de diversos tipos da população da espécie que lhe deu origem.
Assim, em biologia, os zoólogos geralmente consideram ‘raça’ um sinônimo das subespécies, caracterizada pela comprovada existência de linhagens distintas dentro das espécies. Segundo a FAO, é um termo mais cultural que técnico.
Em seus primeiros estágios, todas as raças têm um centro geográfico de origem onde 'determinados animais se assemelham' e, após a domesticação, os criadores desenvolveram seleção e comercialização desse chamado agrupamento biológico. Através de meticuloso registro de pedigrees se tenta isolar esses animais e evitar a migração de genes de outros animais da população.
Raça, então, não são indivíduos nem genótipos particulares; são uma espécie com populações mendelianas animais que segregaram e evoluíram. Isso posto, para fins práticos, uma população é uma Raça quando:
1. tem características que a identifique e/ou;
2. tem uma associação formal de criadores e/ou;
3. quando uma entidade ou governo afirma que ela é.
Do ponto de vista do “Código Internacional de Nomenclatura Zoológica”, não existe nenhuma norma para considerar categorias sistemáticas abaixo da subespécie. Dessa forma, podemos dizer que raça 'puro sangue' é aquela que tenha uma história antiga, com documentação de seus pedigrees em livros genealógicos. Mesmo quando consideradas raças, podem ocorrer desacordos sobre o tipo ou sobre a finalidade dessas. Esse desentendimento pode transformar-se em uma nova divisão sobre padrões da raça e a população, então, pode subdividir-se novamente em dois ou mais subgrupos com coesão própria. Nem por isso, eles deixarão de ser a mesma 'raça' e de serem considerados 'puros' na visão de inventário das descrições de pedigrees.
Depois da domesticação, através do melhoramento e seleção, todas as 'raças' bovinas evoluíram para um tipo mais adequado às necessidades do consumidor.
Prefiro o conceito de recurso genético que nos conduz a uma reflexão mais profunda do que o Gir Leiteiro representa. Recurso sim, em todas suas formas linguísticas, seja como alternativa, auxílio, remédio ou mesmo, patrimônio. Sem dúvida o Gir Leiteiro representa um bem que dispomos para a pecuária leiteira tropical. E mais, uma alternativa aos modelos de produção predominantes no mundo, o “remédio” que auxilia a mudar esta lógica imputada pelos nórdicos aos países em desenvolvimento. Temos Gir Leiteiro como recurso genético dinâmico que tem evoluído no tempo de acordo com as necessidades circunstanciais do Mundo Tropical. A aplicação do conhecimento aconteceu e o melhoramento ocorreu. Há décadas estamos dando “Olé!”.

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Ivan Luz Ledic
21 de abril de 2013

Anibal, trabalho esclarecedor. Somente para agregar mais bibliografia sobre o DNA mitocondrial do Gir Leiteiro, informo o trabalho publicado da Tese de Doutorado do Dr. Sandro Henrique Antunes Ribeiro com o rebanho da Epamig.

RIBEIRO, Sandro Henrique Antunes ; PEREIRA, J. C. C. ; VERNEQUE, R S ; SILVA, Martinho de Almeida e ; BERGMANN, J.A.G. ; LEDIC, Ivan Luz ; Morais, O.R. . Efeitos da origem e da linhagem do DNA mitocondrial sobre características produtivas e reprodutivas de bovinos leiteiros da raça Gir.. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia , v. 61, p. 232-242, 2009.

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Miguel Eduardo Villarreal Torres
16 de abril de 2013
Obrigado pela importante informação.
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Ricardo Imbassahy
15 de abril de 2013

Não quero questionar que a manutenção das raças seja fundamental, mas essa questão de "raça pura" é muito subjetiva. Não tenho dúvidas de que se analisarmos o DNA das grandes campeãs da raça gir na sua variedade leiteira o mtDNA será de Bos taurus.

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