Renovação de diluidor na tecnologia de sêmen de pequenos ruminantes

Introdução

De acordo com os dados disponibilizados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), até abril de 2023, há um total de 434 estabelecimentos ativos e registados no Brasil que trabalham com biotecnologias da reprodução animal. A espécie bovina (336) lidera o ranking, seguida da espécie equina/equídeos (73), suína (43), ovina (26), bubalina (25), caprina (23) e outras espécies (11). Desse total de 434 estabelecimentos, 350 trabalham com sêmen convencional das diversas espécies de produção, 100 trabalham com sêmen sexado e 51, com sêmen heterospérmico.

Quando focamos apenas nos pequenos ruminantes, dos 49 estabelecimentos envolvidos nessa área, 20 deles trabalham com sêmen convencional na espécie ovina e 17 na espécie caprina; e com sêmen sexado, tem-se apenas cinco estabelecimentos na espécie ovina e sete, na caprina.

O panorama acima mostra a diferença existente entre bovinos, espécie com maior capilaridade, e as espécies de pequenos ruminantes, na área de tecnologia de sêmen. Um dos caminhos para diminuir essas desigualdades, passa pela pesquisa e geração de resultados eficientes.

Dentre as várias técnicas, a renovação de diluidor seminal surgiu com intuito de evitar os danos causados pelo acúmulo de metabólitos tóxicos aos espermatozoides durante o resfriamento (Love et al., 2012), fornecendo nova fonte de açucares e lipoproteínas (Busato et al., 2017).

Diante disso, o objetivo desta revisão foi compilar o que se tem na literatura a respeito do efeito da renovação de diluidor seminal, mediante centrifugação, na qualidade do sêmen refrigerado de caprinos e ovinos e no tempo de viabilidade seminal

Renovação de diluidor em sêmen refrigerado de pequenos ruminantes

A utilização do sêmen refrigerado de caprinos e ovinos para a inseminação artificial (IA) é uma estratégia utilizada para maximizar o uso de reprodutores em estações de monta, como também, pode ser uma alternativa ao uso do sêmen criopreservado, por este proporcionar menores taxas de gestação (Siqueira et al., 2009).

O resfriamento seminal à 5 °C mostra-se uma alternativa viável para maiores taxas de gestação. Entretanto, a vida útil da célula espermática em sêmen refrigerado é relativamente curta, tornando necessária a adoção de procedimentos com intuito de prolongar essa vida útil, já que a refrigeração é capaz de manter a motilidade espermática progressiva próxima ao preconizado pelo CBRA, por 48 h em caprinos (Sadeghi et al., 2020) e por 24 h em ovinos (O´hara et al., 2010). Após esse período há declínio da motilidade e outros parâmetros seminais (Sadeghi et al., 2020).

Esse fato está relacionado principalmente às alterações bioquímicas do meio diluidor, que ocorrem ao longo do período de refrigeração, afetando negativamente a viabilidade espermática (Sieme et al., 2016). Entre estas alterações, destaca-se o acúmulo de metabólitos tóxicos aos espermatozoides, como as espécies reativas de oxigênio (ROS), que levam à peroxidação lipídica (Santiani et al., 2014) e consequente declínio da qualidade seminal (Zarei et al., 2021).

Apesar do plasma seminal possuir antioxidantes que preservam as células da ação de ROS, quando os antioxidantes endógenos se tornam insuficientes para atender às demandas celulares, ocorre o estresse oxidativo. Com isso, um dos métodos para prolongar a viabilidade espermática é a adição de antioxidantes ao diluidor com o objetivo de proteger os espermatozoides, por meio da redução da peroxidação lipídica (Zarei et al., 2021).

Outra técnica para prolongar a qualidade de espermatozoides submetidos à refrigeração é a renovação do diluidor, que surgiu para de evitar os danos causados pelo acúmulo de metabólitos tóxicos aos espermatozoides durante a refrigeração (Love et al., 2012). Neste método, o meio exaurido de substratos metabolizáveis e com acúmulo de produtos tóxicos é centrifugado e o pellet de espermatozoides ressuspenso com novo diluidor, fornecendo nova fonte de açúcares e lipoproteínas (Busato et al., 2017).

Um dos primeiros estudos publicados com essa metodologia foi realizado com sêmen de cão, em 2005, por Verstegen et al., seguido por estudos em outras espécies, como a equina (Love et al., 2012; ElBadry et al., 2013; Kiser et al., 2013; Snoeck et al., 2018) e suína (Bury et al., 2017).

Nosso grupo de pesquisa desenvolveu alguns estudos com diferentes metodologias para avaliar a eficiência do método, a necessidade do uso da centrífuga refrigerada nesse processo, o uso de antioxidantes no diluidor para renovação e o tempo de renovação do diluidor em pequenos ruminantes.

Estudos referentes à renovação de diluidor mencionam a necessidade do uso de centrífuga refrigerada, exigência que inviabiliza o uso dessa técnica à campo, mas em estudo recente foi observado que o uso da centrífuga de bancada, à temperatura ambiente, no processo de renovação de diluidor, não afeta a viabilidade do sêmen renovado na espécie ovina (Santos, 2020), como também, na espécie caprina (Santos, 2023, UFRB, Informação Pessoal).

O primeiro estudo foi realizado por Santos (2020), buscando avaliar a eficiência da técnica com sêmen de ovino. Para isto, avaliou o efeito da renovação diária do diluidor sobre a viabilidade do sêmen resfriado de ovinos, e observou que a renovação preservou a motilidade espermática progressiva, o vigor espermático, a integridade da membrana plasmática, a atividade mitocondrial, mantêm o pH próximo à 7, e não interfere na compactação da cromatina e na integridade acrossomal, por 72 h, em relação ao grupo sem renovação.

Essa mesma autora, buscando viabilizar a técnica à campo, observou também que a variação da temperatura durante a centrifugação não afetou a motilidade espermática, o vigor espermático, o pH, a integridade da membrana plasmática e a atividade mitocondrial em sêmen de ovinos resfriado à 5 °C por pelo menos 72 h, viabilizando o uso da centrífuga de bancada, à temperatura ambiente, no processo de renovação para a espécie ovina.

Também realizando estudos em ovinos, Busato et al. (2017) observaram que a motilidade progressiva e o vigor, 5 dias após a coleta seminal, foram maiores no tratamento submetido à renovação diária do diluidor em comparação ao tratamento que não foi submetido à renovação. Os autores concluíram que ocorreu melhora na motilidade progressiva e no vigor espermático após cada centrifugação e renovação, demonstrando que a renovação representa uma opção viável para prolongar a viabilidade do sêmen resfriado de ovinos, o que foi confirmado por Santos em 2020.

Continuando suas pesquisas, Santos (2023, UFRB, Informação Pessoal) avaliou a técnica de renovação de diluidor do sêmen de caprinos, com o objetivo de validar a técnica e também a necessidade da utilização da centrífuga refrigerada, com renovação diária e por 72 h. A renovação de diluidor em sêmen resfriado de caprinos foi benéfica para a motilidade espermática progressiva e vigor espermático com 72 horas de resfriamento, tornando-se uma alternativa viável quando se deseja utilizar o sêmen após 48 horas de resfriamento. Foi observado também que a alteração na temperatura durante a centrifugação não interferiu negativamente na qualidade espermática, validando o uso da centrífuga de bancada para renovação de sêmen de bode.

Também foram realizados estudos em caprinos por Zhao et al. (2009), os quais realizaram estudo com fertilização in vitro utilizando sêmen de bode submetido à renovação de diluente à cada 48 h por 13 dias. Os autores relataram que as taxas de clivagem, indicando fertilização, foram similares às obtidas utilizando sêmen fresco, até o 11° dia de armazenamento à 5 °C.

Santos (2023, UFRB, Informação Pessoal) também avaliou o efeito do uso de trolox, como antioxidante, na viabilidade do sêmen refrigerado de caprinos submetido à renovação de diluidor e concluiu que a renovação associada à adição de trolox foi benéfica para a manutenção do vigor espermático até 72 horas de resfriamento. Porém, a adição de trolox e vitamina C, associadas ou isoladamente, não exerceram influência sobre os demais parâmetros seminais, sendo necessário avaliar além das 72 horas de resfriamento.

Verstegen et al. (2005) também buscaram investigar o efeito dessa renovação, mas sobre o tempo de armazenamento de sêmen de cães. Para isto, coletaram sêmen de cinco cães adultos e trabalharam com pool. O sêmen foi diluído, armazenado a 4 °C e avaliado diariamente. No dia 11, ao perceberem diminuição na motilidade, realizaram a primeira renovação, a qual promoveu aumento na motilidade até o dia 21, quando foi feita nova renovação, resultando em melhora na motilidade novamente. Depois disso, uma terceira renovação foi feita no dia 27, mas não houve resposta quanto à motilidade. Verstegen et al. (2005) ainda mencionaram a possibilidade da gema de ovo possuir papel central na reativação dos espermatozoides após a renovação, devido ao substrato energético e adição de fosfolipídios.

Love et al. (2012), por sua vez, estudaram a possibilidade de prolongar a qualidade do sêmen resfriado de equinos por meio da renovação diária de diluidor em sêmen com diferentes proporções de plasma seminal, armazenado de 4 a 7 °C por 96 h e constataram que a motilidade de espermatozoides refrigerados armazenados por 24 horas com 50% do plasma seminal, pode ser mantida se o sêmen for centrifugado e ressuspendido diariamente com diluente fresco contendo 10% de plasma seminal. Demonstraram também, que este protocolo de renovação preserva a qualidade do sêmen de equinos por até 4 dias.

Já Snoeck et al. (2018) obtiveram espermatozoides móveis de equinos, até 5 dias após a coleta de sêmen, através de centrifugação e renovação do diluidor a cada 48 horas. El-Badry et al. (2013) verificaram que a centrifugação e renovação não causam efeitos deletérios ao sêmen refrigerado de equinos.

Kiser et al. (2013) analisaram sêmen equino e compararam a taxa de gestação, inseminando éguas com sêmen fresco; sêmen resfriado armazenado por 96 h sem renovação; e sêmen resfriado renovado diariamente por 72 h. Ao avaliarem a taxa de gestação, não obtiveram diferença entre os grupos, e reportaram uma taxa de 45% nos grupos inseminados com sêmen não renovado e 58% em grupo inseminado com sêmen renovado.

Em contrapartida, Bury et al. (2017) trabalharam com sêmen de suínos, comparando: grupo controle sem renovação; grupos em que centrifugou e fizeram a ressuspensão no próprio sobrenadante, e grupo que centrifugou, descartou o sobrenadante para remover o plasma seminal e ressuspenderam em novo diluente. Os autores avaliaram a motilidade espermática após a centrifugação a cada 24 h até 96h, e concluíram que a centrifugação pode danificar os espermatozoides de varrões, porém esse dano não é perceptível até 72 h, e com isso não afetaria a fertilidade se usado antes desse período.

Atualmente, nossa equipe está avaliando a frequência de renovação do diluidor em ovinos (24, 48 e 72 h) por seis dias, como também, o efeito do uso de outros antioxidantes e aditivos.

Considerações Finais

Os avanços na tecnologia do sêmen são notáveis. Há um anseio por aumentar o período de viabilidade seminal sem perder a qualidade espermática. Por isso, a renovação de diluidor é uma estratégia promissora, principalmente pela fácil aplicabilidade, por isso, é importante que se cheguem à resultados consolidados. Ao validar o uso da centrífuga de bancada torna a técnica mais acessível, viabilizando a renovação.

Publicado originalmente na Anais do XXV Congresso Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA-2023), Belo Horizonte, MG, 24 a 26 de maio de

2023.DOI: 10.21451/1809-3000.RBRA2023.046. Acesso disponível em: Renovação de diluidor na tecnologia de sêmen de pequenos ruminantes | Semantic Scholar