fungos filamentosos aflatoxinas Polimerase

Nos últimos anos, a crescente preocupação com a segurança (inocuidade) de produtos agrícolas aliada à questão de saudabilidade e de utilização de métodos analíticos mais sensíveis têm levado os países importadores a serem mais exigentes quanto à segurança dos produtos. A contaminação de grãos e alimentos, por fungos cosmopolitas, como Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus é muito comum. Esses fungos filamentosos são produtores de aflatoxinas, que são metabólitos tóxicos potencialmente carcinogênicos (Bullerman, 1979).

As culturas de amendoim, castanha do Brasil, milho, entre outras assumem uma grande importância devido à geração de divisas para o Brasil nos mercados interno e externo, principalmente, com as exportações para a União Européia e os Estados Unidos. Atualmente, as exportações de alguns destes commodities estão seriamente comprometidas, pois a produção brasileira de, principalmente, castanha tem sido afetada por crescente contaminação por aflatoxinas (Cartaxo et al., 2003; Siqueira, 1998). Por outro lado, os limites admissíveis vem sendo reduzidos, demandando métodos analíticos mais sensíveis para sua quantificação. Desta forma, existe a necessidade de desenvolver metodologias mais sensíveis e específicas para a detecção e quantificação de fungos filamentosos produtores de aflatoxinas, para que os produtos consumidos nos mercados internos e exportados possam atender às exigências nacionais e internacionais cujos limites máximos de presença de aflatoxinas, estabelecidos pelo regulamento 2001/466/CE (Brasil, 2000), são de 4 ppb (sendo 2 ppb para a aflatoxina B1) e de 20 ppb de aflatoxinas total, para o Brasil.

 

As micotoxinas pertencem a diferentes classes químicas com diferentes estruturas moleculares, como poliquetídeos, isoprenos e aminoácidos (Martin, 1992). Já foram identificadas cerca de 300 diferentes micotoxinas, mas apenas 20 destas são relevantes para a saúde humana. As principais enfermidades causadas pelas micotoxinas incluem efeitos teratogênicos, imunosupressivos, tremorgênicos, nefrotóxicos, hepatóxicos e carcinogênicos (Bullerman, 1979).

As aflatoxinas apresentam efeitos agudos e crônicos em animais e humanos. As aflatoxinas atacam primeiramente o fígado, causando necrose, cirrose e carcinomas. Não há relato da existência de animais resistentes às aflatoxinas, embora haja diferença de suscetibilidade de espécie para espécie. A aflatoxina B1 é a responsável pelos carcinomas em animais, apresentando uma forte relação com a incidência de câncer em humanos (Chu, 1991; Estados..., 1999).

A produção de aflatoxinas é potencializada pelas condições climáticas (temperatura e umidade) e de armazenamento de produtos agrícolas. Os métodos atualmente utilizados para o isolamento e identificação de fungos produtores de aflatoxinas baseiam-se em métodos convencionais através do cultivo em meios de cultura semi-seletivos/específicos para fungos aflatoxígenos. O tempo para o isolamento dos fungos é longo e a identificação demanda conhecimentos profundos em taxonomia. As análises qualitativas e quantitativas das aflatoxinas são conduzidas por cromatografia em camada fina e por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), respectivamente.

 

Diversos trabalhos têm sido realizados no sentido de desenvolver metodologias sensíveis e específicas para detecção de fungos produtores de aflatoxinas. Nesses estudos, verificou-se que a utilização de primers específicos para a amplificação de genes, que codificam proteínas-chave da via de biossíntese das aflatoxinas, por PCR (DNA Polymerase Chain Reaction) detecta especificamente fungos produtores de aflatoxina. Isso demonstra que essa estratégia é a base para o desenvolvimento de um sistema de detecção de fungos aflatoxigênicos com maior sensibilidade e especificidade, em produtos agrícolas e alimentos em geral (Shapira et al., 1996; Kusumoto et al., 1998; Sweeney et al., 2000).

Para que o método detecção baseado na PCR seja aplicável, os alvos para amplificação devem ser genes unívocos. Além disso, estes genes só devem estar presentes nos fungos filamentosos produtores de aflatoxinas. Dessa forma, a utilização dos primers permite a amplificação específica dos genes envolvidos com a via de biossíntese da micotoxina, obtendo-se amplicons (produto da PCR) de DNA de fungos produtores, enquanto a PCR de DNA de fungos não aflatoxígenos resultaria em não amplificação (Fig. 1).

Diante disso, diversos estudos foram conduzidos no que diz respeito ao conhecimento da via de biossíntese da aflatoxina (B1), na identificação de proteínas-chave e na identificação e seqüenciamento de genes que codificam tais proteínas-chave (Trail et al., 1995; Brown et al., 1999). Os principais genes expressos durante a biossíntese da aflatoxina produzida por cepas do gênero Aspergillus são aflR, avfA, avfA1,ord-1, omt-1, ver-1, omtB, entre outros (Shapira et al., 1996; Kusumoto et al., 1998; Yu et al., 2000; Sweeney et al., 2000; O´Brian et al., 2003; Yu et al., 2004). Na representação esquemática da Fig.2, destacam-se os genes envolvidos na rota de biossíntese da aflatoxina B1 e da esterigmatocistina.

Fig. 1. Utilização da Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR) para detecção de fungos filamentosos micotoxígenos

Fig. 2. Rota de biossíntese de esterigmatocistina e aflatoxina B1 em Aspergillus flavus.

 

As aflatoxinas são metabólitos secundários altamente tóxicos e carcinogênicos para os animais e seres humanos. O impacto na saúde e na economia causado pela presença de aflatoxinas em produtos agrícolas tem promovido um aumento no número de estudos relacionados com a genética e com a via de biossíntese dessas micotoxinas. Diversos trabalhos têm sido realizados no sentido de desenvolver metodologias sensíveis e específicas para detecção de fungos produtores de aflatoxinas. Nesses estudos, tem sido verificada a utilização de primers específicos para a amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) de genes codificadores de proteínas-chave da via de biossíntese, detectando especificamente fungos produtores de aflatoxina. O objetivo deste trabalho foi apresentar uma atualização das estratégias que já estão sendo realizadas para detecção de fungos filamentosos produtores de aflatoxinas, as quais utilizam a metodologia molecular: PCR.

 

A detecção de fungos aflatoxígenos em alimentos processados requer, na maioria das situações, um pré-tratamento da amostra antes da extração do DNA total. Este procedimento é importante para evitar a presença de inibidores de PCR (gorduras, carboidratos, proteínas, acidez, etc.). Sendo assim, é importante que o DNA extraído seja o mais limpo possível, ou seja, livre de inibidores, para que os resultados não sejam erroneamente considerados negativos para a presença de fungos aflatoxígenos (Edwards et al., 2002).

 

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução normativa n.º 9, de 24 de março de 2000. Aprova os métodos analíticos de referência para análise de micotoxinas em produtos, subprodutos e derivados de origem vegetal. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 30 mar. 2000. Seção 9, p. 39. (seção 1).

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