Bacteriófagos líticos controle biológico Salmonella Enteritidis avicultura

O controle das salmonelas paratíficas na avicultura está diretamente relacionado à importância da bactéria na segurança dos alimentos. Especificamente, a S. Enteritidis fagotipo (PT) 4 é o sorovar mais prevalente na avicultura, bem como o mais envolvido nos casos de infecção em humanos decorrentes do consumo de carne de frango ou ovos contaminados. A epidemiologia da Salmonella é bastante complexa e por isso o controle da bactéria envolve iniciativas em todos os pontos da cadeia produtiva, desde a granja, passando pelo abate, processamento da carne, e manipulação do alimento pelos consumidores. No campo, as frequentes discussões sobre o uso de antimicrobianos para tratamento de animais de produção infectados, assim como as questões do constante surgimento de bactérias resistentes e a baixa taxa de desenvolvimento de novos antimicrobianos fomentam a buscar por alternativa para o controle de bactérias de importância para a saúde animal e para a segurança dos alimentos. Dentre as possibilidades para controle de S. Enteritidis PT4, com perspectivas de aplicação tanto em frangos de corte quanto em alimentos, estão os bacteriófagos líticos, ainda sem opção comercial no Brasil porém com vasto campo para pesquisa científica.

Bacteriófagos (ou fagos) são vírus que infectam bactérias e não atacam células de eucariotos. Os bacteriófagos estão presentes no ambiente em um número superior às bactérias e podem ser isolados de diferentes fontes ambientais, como solos, água e fezes, e diretamente de animais. Quanto à sua morfologia, exibem uma ampla variedade, contudo a maioria dos bacteriófagos atualmente conhecidos apresenta cabeça (ou capsídeo viral), normalmente de formato icosaédrico, contendo o ácido nucléico, que pode ser DNA fita simples ou dupla, ou ainda RNA; e uma estrutura em forma de cauda, que apresenta receptores que reconhecem sítios de ligação na bactéria hospedeira (Figura 1).

Há duas possibilidades de ciclo de vida para os bacteriófagos. No ciclo lítico, característico dos bacteriófagos virulentos, a replicação viral ocorre no interior da célula hospedeira, causando o rompimento e a consequente destruição da bactéria com a liberação de novas partículas víricas com potencial de ligação a novas células-alvo. Já o ciclo lisogênico caracteriza os bacteriófagos temperados, cujo material genético integra-se ao genoma da bactéria permanecendo num estado quiescente conhecido como profago. Esse material replica-se de forma concomitante à duplicação do genoma da bactéria hospedeira, no qual permanece integrado, de modo que as bactérias originadas também contêm o profago.

Os bacteriófagos que desenvolvem o ciclo lítico são os que apresentam potencial para uso como controle biológico de bactérias. Esses fagos ligam-se a receptores específicos da bactéria-alvo, que podem ser proteínas, peptidioglicano, lipopolissacarídeos, cápsula ou flagelo. Após essa ligação, o material genético do bacteriófago é injetado no interior da bactéria, que nos fagos caudados ocorre por meio de contração da cauda. Segue-se então a replicação viral, pela qual o genoma do bacteriófago é transcrito pela RNA polimerase da bactéria hospedeira, gerando RNA mensageiro e redirecionando a maquinaria metabólica da bactéria para a formação de novas partículas víricas, que reúnem-se formando novos fagos, liberados após o rompimento da bactéria.

O emprego de bacteriófagos líticos no tratamento de infecções bacterianas iniciou anteriormente à descoberta da penicilina e foi intensamente pesquisado na antiga União das Repúblicas Socialistas Soviéticas e países do leste europeu. Nos demais países, o interesse pelos bacteriófagos diminuiu após a descoberta dos antimicrobianos, somando-se também à dificuldade em acessar as pesquisas realizadas, grande parte documentada em outros idiomas que não o inglês, e muitas carecendo de delineamento experimental adequado e de resultados concretos e reprodutíveis. Nas últimas duas décadas o interesse pela pesquisa com bacteriófagos vem reaparecendo, impulsionado pela baixa taxa de desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas, o que pode ser comprovado pelo número de grupos de pesquisa que estudam o assunto e pela vasta produção bibliográfica resultante.

A Embrapa Suínos e Aves vem pesquisando a aplicação de bacteriófagos líticos para o controle biológico de S. Enteritidis PT4 em frangos de corte desde 2001. Três bacteriófagos líticos, identificados no laboratório como CNPSA 1, CNPSA 3 e CNPSA 4, foram isolados de fezes de aves e demonstraram efeito sobre amostras de referência de S.Enteritidis e S. Typhimurium. Em condições experimentais, um pool contendo esses três bacteriófagos é administrado de modo terapêutico a frangos infectados por S. Enteritidis PT4, por meio da água fornecida às aves, sendo o efeito medido pela redução da bactéria no conteúdo intestinal. Os bacteriófagos não foram isolados dos órgãos das aves tratadas, indicando que não são invasivos. Estes bacteriófagos apresentam estrutura de cabeça e cauda medindo entre 80 e 120nm, com genoma do tipo DNA dupla fita e multiplicam-se no intestino de frangos infectados por S. Enteritidis PT4 (6).

Um ponto a ser considerado na viabilidade do uso de bacteriófagos no controle biológico de bactérias é o desenvolvimento de resistência. Diferentes grupos de pesquisa vêm utilizando uma preparação contendo ao menos 3 bacteriófagos para o tratamento de aves infectadas (13,4). Neste sentido, uma mistura terapêutica contendo diferentes bacteriófagos líticos com comprovada ação sobre uma determinada bactéria parece aumentar a eficiência do tratamento. Os bacteriófagos estudados pela Embrapa apresentam perfis de genotipificação distintos entre si (Figura 2), indicando que, a pesar de compartilharem a mesma morfologia, são fagos diferentes. O sequenciamento de fragmentos aleatórios do DNA desses bacteriófagos não permitiu identificar similaridades significativas frente a outras sequências de DNA de bacteriófagos já descritas, porém as maiores similaridades foram encontradas junto a sequências de DNA de fagos pertencentes às famílias Podoviridae, Myoviridae eSiphoviridae (14), reforçando que os fagos pesquisados pela Embrapa pertencem à ordem dos Caudovirales que engloba os bacteriófagos de morfologia caudada (1).

Frangos de corte infectados por meio do contato com aves positivas para S. Enteritidis PT4 (seeder birds) foram utilizados para avaliar o efeito destes três bacteriófagos na redução da bactéria no ceco. No primeiro dia de vida foram tratados com o pool contendo os 3 bacteriófagos líticos através da água fornecida, sendo a contaminação do ceco quantificada em intervalos de 5 dias. Após 5 dias de tratamento, as aves apresentaram redução de 3,5 vezes na concentração da bactéria em relação ao grupo não tratado (168,2x10⁸ para 48X10⁸ UFC/g). Embora a S. Enteritidis PT4 não tenha sido eliminada em magnitude logarítmica, foi possível demonstrar que os fagos possuem efeito de redução da bactéria quando administrados de forma terapêutica (7).

Já com o objetivo de verificar a ação desses bacteriófagos líticos em diferentes fases de crescimento das aves, dois grupos de frangos foram infectados com S. Enteritidis PT4 no primeiro dia de vida, sendo o tratamento com bacteriófagos administrado a um grupo entre o 6° e 10° dias de vida, e ao outro grupo entre o 31° e 35° dias de vida, respectivamente. Em relação aos grupos controle (infectados porém não tratados), houve diferença significativa na redução da bactéria no ceco das aves quando o tratamento foi aplicado na fase inicial de crescimento, período em que o nível de infecção por S. Enteritidis PT4 foi maior; porém não houve diferença estatística no grupo tratado na fase final de crescimento, sugerindo que os bacteriófagos pesquisados pela Embrapa atuam de forma mais eficiente frente a altas concentrações da bactéria (9).

Bacteriófagos líticos podem apresentar ação específica frente a uma única espécie de bactéria, ou mesmo a uma única cepa de uma espécie, porém fagos com efeito sobre diferentes espécies bacterianas já foram descritos (3). Um dos requisitos para o uso terapêutico de bacteriófagos líticos é assegurar a atuação específica sobre a bactéria-alvo sem afetar a flora normal das aves tratadas. O efeito dos bacteriófagos pesquisados pela Embrapa foi analisado frente a S. Enteritidis PT4 isoladas no Brasil, assim como outros fagotipos de S. Enteritidis e sorovares de Salmonella de diferentes sorogrupos isolados de aves no país. Os três bacteriófagos apresentaram ação sobre S. Enteritidis e S. Typhimurium (controle positivo) e não sobre outros sorovares isolados de aves, tendo efeito sobre os diferentes fagotipos de S. Enteritidis testados, exceto o PT6. Os fagos também apresentaram efeito frente a maioria dos isolados PT4 obtidos no Brasil que foram analisados. Não houve efeito sobre outras bactérias testadas (Tabela 1), dentre as quais Lactobacillus (2). Considerando a importância de Lactobacillus na flora das aves e sendo um gênero que muitas vezes compõe formulações de exclusão competitiva, o uso desses bacteriófagos líticos associado à exclusão competitiva parece ser uma opção para aumentar a redução de S. Enteritidis no trato intestinal de frangos.

Os bacteriófagos pesquisados pela Embrapa podem também ter aplicação na redução de Salmonella em suínos. Esses bacteriófagos foram testados individualmente frente a S. Typhimurium isoladas de suínos, numa MOI de 1000, ou seja, 1000 partículas víricas para cada célula bacteriana. Houve ação dos três bacteriófagos frente a todas as cepas de S. Typhimurium testadas (12). Já a excreção viral foi avaliada em leitões tratados pela via oral com os três bacteriófagos. Dois grupos de leitões SPF, cada qual contendo 5 animais, receberam uma única dose do pool de bacteriófagos, sendo um grupo infectado com S. Typhimurium dois dias antes do tratamento. No 4° dia pós-tratamento, os fagos foram isolados de suabes retais coletados de 2 dos 5 animais infectados e tratados e de 1 dos 5 animais não infectados e tratados. Os bacteriófagos não foram inativados pela acidez estomacal, porém foram rapidamente eliminados, mesmo em presença de S. Typhimurium (11). O estudo sobre a farmacocinética desses fagos precisa ser aprofundado para melhorar a eficiência do tratamento. É possível que a administração em doses contínuas aumente a permanência dos fagos no trato intestinal, favorecendo com isso o contato com a bactéria.

Em 2006 o FDA aprovou uma preparação contendo seis bacteriófagos líticos com ação sobre Listeria (L.) monocytogenes para uso em alimentos prontos para o consumo (10), estimulando a pesquisa com bacteriófagos voltada à aplicação em alimentos. Cortes de frango contaminados experimentalmente com uma elevada dose de S. Enteritidis PT4 (10⁶ UFC/mL) e posteriormente submetidos à aplicação da preparação contendo os três fagos isolados pela Embrapa apresentaram redução significativa na contagem de UFCs nos dias 3, 6 e 9 pós tratamento, que contudo não foi suficiente para eliminar a bactéria do produto (8). A ação dos bacteriófagos líticos pode estar relacionada à dose e frequência de administração. Um estudo com o bacteriófago lítico denominado P100, utilizado para reduzir L. monocytogenes em alimentos, mostrou que a aplicação de doses repetidas desse fago em baixa concentração de UFP (unidade formadora de placa) sobre a superfície de queijos contaminados com a bactéria resultou na diminuição do número de UFC de Listeria em cerca de 2-3 log. Paralelamente, o uso desse mesmo fago em menor concentração, aplicado sobre o alimento tanto em dose única quanto em doses repetidas, eliminou completamente a L. monocytogenes da superfície do produto contaminado (5).

O amplo conhecimento das características biológicas e da farmacocinética dos bacteriófagos líticos é um passo essencial para garantir a segurança do produto usado no controle biológico de bactérias. Isso inclui a completa ausência de resíduos de bactérias ou outras substâncias tóxicas que causem efeitos adversos ao animal tratado, ação específica sobre a bactéria-alvo, desenvolvimento do ciclo lítico, ausência de genes de virulência carreados no genoma que possam ser transmitidos à bactéria-alvo, e completa eliminação destes vírus pelo organismo dos animais não infectados pela bactéria-alvo. Para investigar a estabilidade dos bacteriófagos líticos após a passagem pelo trato intestinal de frangos de corte, os fagos isolados pela Embrapa foram administrados a frangos SPF por meio da água de beber, sendo isolados de suabes de cloaca coletados das aves após o tratamento. O perfil genotípico e de peptídeos dos fagos reisolados foi analisado por AFLP e SDS-PAGE, respectivamente, e não foram encontradas diferenças entre os padrões dos fagos administrados pela água e os padrões dos fagos que foram reisolados das aves, sugerindo que não sofrem alterações genotípicas e de perfil de peptídeos que reflitam na capacidade de lise (15).

Os resultados obtidos até o momento comprovam que os bacteriófagos líticos isolados pela Embrapa atuam sobre Salmonella e são capazes de reduzir o número de UFCs mas não a um nível satisfatório para a indústria, o que não inviabiliza o aperfeiçoamento da tecnologia através da pesquisa, buscando melhorar sua eficiência. Para o aprimoramento do uso desses fagos no controle biológico de S. Enteritidis em aves ou de S. Typhimurium em suínos, as perspectivas de pesquisa concentram-se na otimização da ação in-vivo dos fagos, ampliação da caracterização molecular, estudos de farmacocinética, incluindo formas e tempos de administração, bem como identificação de fatores que interferem na capacidade de lise, de forma a obter uma tecnologia que reflita em índices aceitáveis de redução da infecção pela bactéria, ao mesmo tempo em que seja segura e cuja produção seja industrialmente e economicamente viável. Com isso, uma tecnologia viabilizando o uso destes fagos na avicultura ou em outras áreas de produção não deve ser esperado a curto prazo. Considerando a especificidade dos bacteriófagos líticos isolados pela Embrapa, o seu emprego deve ser ainda pontual, voltado ao controle específico de Salmonella.

(a) Isolados de campo. Amostras de E. coli isoladas de colibacilose aviária gentilmente cedidas pelo Dr. Benito Brito, (b) Isolados de surtos em humanos, fornecidos pela Seção de Microbiologia de Águas e Alimentos, Divisão de Análises de Produtos (IPB-LACEN-RS/FEPPS); (c) Isolados de carne de frango; (nd) Origem não determinada; (+++) Positivo em três repetições; (---) Negativo em três repetições.

1. Ackermann, H. Advances in Virus Research 1998;51:135-201

2. Alves, L., et al. In: Conferência APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2009, Porto Alegre, RS. Anais..., 2009. Publicado em CR-ROM.

3. Bielke, L., et al. Poultry Science 2007;86:2536-40.

4. Borie, C., et al. Avian Diseases 2008;52:64-7.

5. Carlton, R.M et al. Regulatory Toxicology and Pharmacology 2005;43:301-12.

6. Fiorentin, L., et al. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2004;6(2):121-8.

7. Fiorentin, L., et al. Avian Pathology 2005;34(3):258-63.

8. Fiorentin, L., et al. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2005;7(4):255-60.

9. Fiorentin, L., et al. In: Conferência APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2008, Santos, SP. Anais..., 2008. p.241.

10. Peek, R.; Reddy, R. Gastroenterology 2006;131:1370-72.

11. Silveira RH, et al. In: Congresso Brasileiro de Micorbiologia, 2005, Santos, SP. Anais..., 2005. Publicado em CR-ROM.

12. Silveira RH, et al.In: International Symposium Salmonella and Salmonellosis, 2006, Ploufragan, França. Proceedings..., 2006. P.577-78.

13. Toro, H., et al. Avian Diseases 2005;49:118-24.

14. Vaz, C.S.L., et al. In: Conferência APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2009, Porto Alegre, RS. Anais..., 2009. Publicado em CR-ROM.

15. Vaz, C.S.L., et al. In: Conferência APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2009, Porto Alegre, RS. Anais..., 2009. Publicado em CR-ROM.