Alcalóide Células Mucosa Intestinal Frangos

Os alcaloides da benzofenantridina incluem principalmente a sanguinarina e a queleritrina como parte de um grupo de alcalóides da benzofenantridina e da protopina sendo obtidos de algumas plantas. Alguns estudos (Schmeller et al., 1997) indicam que a sanguinarina é capaz de inibir o crescimento de bactérias, afetando diversos pontos da replicação. Frente a isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de um produto comercial composto de alcalóides da benzofenantridina na água de frangos de corte sobre o contagem de Salmonella Enteritidis (SE), avaliação de células imunológicas no sangue, contagem de células CD3+ e células caliciformes na mucosa intestinal de frangos desafiados com SE.

Foram alojados 120 frangos de corte, livres de Salmonella sp., do 1° ao 21° dia de idade divididos em 2 tratamentos, em um desenho experimental inteiramente casualizado, sendo um tratamento Controle (T1) sem adição de antibióticos ou outros aditivos adicionados na ração ou água dos animais e tratamento (T2) composto por uma ração controle e adição de 100g/1000L de alcaloides da benzofenantridina (Sangrovit^®, Phytobiotics, Londrina, PR, Brasil) em água destilada. Aos 14 dias de idade todos os animais foram inoculados com 1 mL de uma solução oral de SE em uma concentração de 10⁵ UFC/mL. Os animais passaram a receber o aditivo em água destilada 24 horas pós-inoculação, sendo esta água substituída a cada 12 horas.
No 21º dia de idade (7 dias após inoculação com SE) as aves foram eutanasiadas e necropsiadas com coleta de papos e cecos para análise de Salmonella sp. Para realização do procedimento de contagem de Salmonella os papos e os cecos foram diluídos em água peptonada 2% em proporção de 1:9. Retirou-se 1 mL da solução de água peptonada 2% que foi pipetado no tubo contendo 9 mL de água peptonada 0,1% e assim sucessivamente até a diluição 10^-3, posteriormente retirou-se 100 μL de cada diluição plaqueou-se em duplicata em meio XLD e com uma alça de drigalsky espalhou-se o líquido na placa. As placas foram incubadas em estufa regulada a 35°C por 24h e submetidas a posterior contagem das colônias típicas (adaptado de Desmidt et al., 1997). A solução inicial de água peptonada 2% foi incubados à 35°C por 24h, em caso de não ter ocorrido crescimento de colônias típicas de SE após 24h de incubação em alguma amostra, retirou-se 100 μL da solução inicial em água peptonada 2% e acrescentou-se em um tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis, incubou-se em estufa regulada a 42°C por 24h para confirmação.Os resultados das contagens de colônias foram expressos de acordo com Procedimentos de Contagem de Colônia de acordo com a Normativa nº62 publicada em 26 de agosto de 2003 (MAPA, 2003).
Fragmentos de duodeno, jejuno, íleo e ceco também foram coletados em formalina tamponada 10% para análise de células CD3+ por meio de imunohistoquímica e células caliciformes por meio de histopatologia (coloração de Alcian Blue) na mucosa intestinal. A contagem de células caliciformes e CD3+ foi realizada por meio de microscópio óptico. Para as células CD3+, 10 campos por tratamento foram lidos e para células caliciformes 20 vilos/tratamento foram lidos em aumento de 40X. Aos 21 dias de idade também foi coletado sangue de 4 animais por tratamento para realização de citometria de fluxo. Os resultados do experimento foram submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o software StatView SAS e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Na tabela 1 estão apresentados os dados referentes a contagem de SE em ceco e papo 7 dias pós inoculção com SE. Observa-se que o aditivo à base de alcaloides da benzofenantridina na água mostrou-se eficaz em combater a colonização de SE em ceco e papo de frangos 7 dias após inoculação com SE, reduzindo significativamente a contagem desta bactéria, quando comparado ao grupo controle.

Tabela 1. Contagem de Salmonella Enteritidis (Log10 UFC) em ceco e papo de frangos (7 dias pós-inoculação com SE) nos diferentes tratamentos

Na Tabela 2 encontram-se os resultados das médias e desvio padrão das contagens de células caliciformes e CD3+ da mucosa intestinal de duodeno, jejuno, íleo e ceco de frangos de corte inoculados com SE, 7 dias após inoculação.
De acordo com os resultados em duodeno e jejuno, observamos maior quantidade de células caliciformes no grupo controle, bem como maior número de células CD3+ em duodeno, jejuno e íleo deste mesmo tratamento.

Tabela 2. Contagem de células caliciformes/vilo e CD3+/campo em duodeno, jejuno, íleo e ceco de frangos inoculados com SE (7 dias PI) nos diferentes tratamentos

As células caliciformes são as células produtoras de glicoproteínas (muco) e tem funções de proteção da mucosa intestinal contra agentes abrasivos da dieta e agentes patogênicos e também participa na absorção dos nutrientes. O muco participa da resposta imune inespecífica, e quando há grande expressão de células caliciformes significa que pode haver algum tipo de desafio sanitário que demande maior produção de muco. Em contrapartida, o muco quando em grandes quantidades pode trazer prejuízos para a saúde da ave, pois aumenta o trânsito intestinal, reduzindo a absorção dos nutrientes. Já as células CD3+ são linfócitos T, que participam da resposta imune específica do animal (Murphy et al., 2010).
A Tabela 3 apresenta os resultados da citometria de fluxo. Podemos observar maior proporção de células imunológicas no sangue (CD4, CD8α, CD8α^Bright, CD8β, TCR αβ Vβ1, CD28) dos animais do tratamento onde foi utilizado a benzofenantridina na água de bebida. Esses resultados contrastam com menor número de células CD3+ e células caliciformes na mucosa intestinal do jejuno nas aves do grupo tratado com alcalóide de sanguinária na água de bebida quando comparado ao controle.

Tabela 3. Proporções de células circulantes no sangue de frangos de corte aos 21 dias de idade e após 7 dias da inoculação com SE, de acordo com a subpopulação identificada (ou a razão entre as populações CD4+ e CD8+)

O controle de SE demonstrado pelos alcaloides da benzofenatridina na análise microbiológica culminou com resposta imunológica menos intensa da ave (menor presença de células CD3+ e maior proporção de marcadores de células imunológicas no sangue dos animais). Gonzales-Begné et al. (2001) associaram o uso destes alcalóides com a redução de gengivites em seres humanos e associaram estes resultados com as propriedades antimicrobianas e antiinflamatórias deste composto.

O alcalóide de benzofenantridina adicionada na água de frangos de corte inoculados com SE reduziu a excreção de SE em papo e ceco e reduziu o número de células caliciformes e CD3+ na mucosa intestinal e aumentou a proporção de células imunológicas no sangue aos 21 dias de idade. Estes resultados se traduzem em menor gasto metabólico das aves recebendo os alcalóides da benzofenantridina, pois o controle de Salmonella demonstrado pelo produto na análise microbiológica culminou com resposta imunológica menos intensa da ave. Porém mais estudos são necessários para avaliação destes componentes para frangos de corte.

Mapa (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). 2003. Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. Instrução Normativa nº62 publicada em 26 de agosto. Brasil.

Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck F. 1998. Serological and bacteriological observations on experimental infection with Salmonella Hadar in chickens. Vet. Microbiol. 60: 259-269.

Gonzalez-Begné M, Yslas N, Reyes E, Quiroz V, Santana J, Jimenez G. 2001. Clinical effect Mexican Sanguinaria extract (Polygonum aiculare L.) on gingivitis. J. Ethnopharmacol. 74:45-51.

Murphy K, Travers P, Walport M. 2010. Imunobiologia de Janeway. Porto Alegre: Artmed.

Schmeller T, Latz-Brüning B, Wink M. 1997. Biochemical activities of berberine, palmatine and sanguinarine mediating chemical defence against microorganisms and herbivores. Phytochemistry 44:257-266.