Introdução
A avicultura destaca-se entre as atividades do setor agropecuário mundial, com índices de produção em constante crescimento. O aumento na produção de carne de frangos foi conseqüência de avanços em genética, nutrição, sanidade e manejo, que elevaram os níveis de produtividade e desempenho. No entanto, alguns aspectos como bem-estar e imunocompetência das aves foram, em parte, negligenciados.
O frango moderno tem pouca capacidade de resposta a situações de estresse, como calor, frio, vento, fome e densidade populacional. A capacidade de adaptação do animal a estas circunstâncias determina ou não seu estado de estresse. O frango moderno tem pouca capacidade de termorregulação; é bem mais sensível ao calor que ao frio. Segundo Ferket & Qureshi (1992), muitas produções de frango no mundo estão situadas em locais onde o estresse causado por altas temperaturas ambientais limita o desempenho e aumenta a sensibilidade a doenças. Aves submetidas a estresse ambiental geralmente têm sua função imune reduzida (Thaxton & Siegel, 1970; Brake, 1989; Siegel, 1989; Miller & Qureshi, 1991).
Alguns parâmetros comumente utilizados para estimar a imunidade de aves são o peso de órgãos linfóides (Pope, 1991), a resposta de anticorpos a antígenos estranhos (Montgomery et al., 1991; Patterson & Siegel, 1998; Scott et al., 1994), a relação heterófilo:linfócito (H:L) (Al-Murrani et al., 1997; Patterson & Siegel, 1998) e os ensaios de blastogênese de linfócitos (Talebi et al., 1995; Gogal et al., 1997). O peso de órgãos linfóides é facilmente medido e reflete a capacidade do organismo de produzir células linfóides durante uma resposta imune.
Não se sabe ao certo se o efeito prejudicial do estresse por calor na função imune de aves pode ser superado com o fornecimento de alguns nutrientes. Ferket & Qureshi (1992) observaram que a suplementação vitamínica (vitaminas A, D, E e complexo B) durante estresse por calor episódico foi benéfica nos estágios de indução e maturação da resposta de síntese de anticorpos.
Características de desempenho e função imune de aves que sofreram estresse por calor são significativamente melhoradas com o aumento nos níveis de vitamina C (Pardue & Thaxton, 1984; Pardue et al., 1985), vitamina E (El-Boushy, 1988) e piridoxina (Blalock et al., 1984). Níveis moderados de vitamina E na dieta (50 UI/kg) de aves elevaram a produção de anticorpos para eritrócitos ovinos, enquanto o mesmo não ocorreu com níveis mais altos (100 e 200 UI/kg) (Leshchinsky & Klasing, 2001). O selênio também faz parte do sistema antioxidante natural, poupando a vitamina E, de modo que patos alimentados com dietas suplementadas com selênio apresentam concentrações mais elevadas de vitamina E no plasma (Combs, 1975). Thornton (1961) relatou que os níveis de ácido ascórbico sangüíneo em aves estressadas por calor foram marcadamente reduzidos e sugeriu que o estresse poderia criar exigência de suplementação com vitamina C.
Também o Zinco (Zn) é um nutriente a ser considerado. Durante a reação imunológica, o nível desse mineral no sangue decresce drasticamente em razão da síntese de metalotioneína no fígado e, em contrapartida, a absorção é aumentada, provocando aumento na exigência deste mineral. Kidd et al. (1994) avaliaram os efeitos da suplementação de zinco em dietas para perus com níveis adequados deste mineral e observaram que a adição de 30 ou 45 ppm de zinco a partir da utilização de zinco-metionina aumentou significativamente a capacidade de resposta imune celular de perus jovens.
Esta pesquisa foi realizada com os objetivos de estudar os efeitos da suplementação de vitaminas E e C, dos minerais orgânicos Zn e Se e da temperatura ambiental na imunidade humoral de frangos de corte desafiados com albumina sérica bovina (BSA) e avaliar a inoculação com BSA como estratégia para medir a imunidade humoral e os efeitos desse desafio no desempenho de frangos de corte.
Material e Métodos
O experimento foi conduzido no período de novembro a dezembro de 2003. Foram utilizados 468 pintos de corte machos, linhagem Ross 308, de 1 dia de idade, com peso inicial de 44 ± 0,2 g. As aves foram criadas, até os 14 dias, em 78 gaiolas metálicas de 0,72 m2, em sala climatizada, com temperatura inicial de 31±1 oC, decrescendo gradativamente até aproximadamente 24±1 oC. Nesta fase, as aves foram distribuídas aleatoriamente (seis em cada gaiola) e alimentadas com quatro dietas suplementadas com vitaminas e/ou minerais. As dietas foram: D1 - dieta controle, com os níveis vitamínicos e minerais contidos no premix; D2 - dieta controle + suplementação vitamínica de 100 UI vit. E e 300 ppm vit. C/kg de ração; D3 - dieta controle + suplementação mineral de 40 ppm Zn e 0,3 ppm Se/kg de ração; D4 - dieta controle + suplementação vitamínico-mineral nos níveis de D2 + D3.
A vitamina E foi suplementada na forma de acetato dl-µ tocoferol (RocheÒ) e a vitamina C na forma de ácido ascórbico (RocheÒ). O zinco e o selênio foram suplementados na forma orgânica (ZinproÒ).
Aos 14 dias, 272 aves (quatro aves por gaiola) selecionadas aleatoriamente foram distribuídas em 68 gaiolas de 0,90 m2, em dois ambientes – termoneutro (ATN) e estresse por calor (EPC) – com oito repetições por tipo de suplementação no EPC e nove repetições por tipo de suplementação no ATN.
Consideraram-se EPC 12 horas de temperatura a 25°C, 3 horas de 25 a 32°C, 6 horas a 32°C e 3 horas de 32 a 25°C diariamente, e ATN, temperaturas diárias na faixa de 21 a 25°C. A umidade relativa do ar manteve-se em torno de 70% nos dois ambientes. O monitoramento da temperatura e da umidade relativa do ar de cada ambiente foi feito por termômetro de bulbo seco e bulbo úmido e de máxima e mínima, colocados à altura intermediária das gaiolas. O programa de luz adotado durante o experimento foi contínuo (24 horas de luz artificial/dia). As aves receberam ração e água à vontade e mesmo manejo durante todo o período experimental.
A composição nutricional e de ingredientes (Tabela 2) utilizada nas dietas do período inicial e de crescimento foi calculada conforme descrito por Rostagno et al. (2000). As aves foram alimentadas no período de 1 a 21 dias com a ração inicial e dos 21 aos 35 dias receberam a ração de crescimento. Os níveis de suplementação de vitaminas e minerais foram os mesmos nas fases inicial e de crescimento.
Seis repetições no tratamento com EPC e cinco repetições no tratamento em ATN foram inoculadas com albumina sérica bovina (BSA) diluída em solução tampão fosfato (PBS) aos 12 e 24 dias de idade para posterior medida de anticorpos produzida contra este antígeno, portanto, a inoculação consistiu em um terceiro fator no modelo estudado, o qual foi composto, ao final, de um fatorial 4 × 2 × 2 (quatro tipos de suplementação vitamínico-mineral, dois ambientes e inoculação ou não com BSA). As aves restantes foram inoculadas com solução tampão fosfato (PBS) como controle negativo.
O preparo da vacina de BSA foi feito a partir de uma solução contendo 16 mg BSA/mL, de modo que 1 mL desta solução foi diluído em 15 mL de PBS. A nova solução foi misturada em mesmo volume de adjuvante incompleto, composto de 85% óleo mineral e 15% de lanolina. A mistura foi agitada lentamente até adquirir consistência de emulsão. A vacina foi aplicada na dose de 0,4 mL/ave, via intramuscular (músculo de peito).
As aves foram pesadas no início do período experimental e semanalmente para determinação do ganho de peso. O consumo de ração foi calculado considerando a quantidade de ração fornecida, as sobras nos comedouros e os desperdícios. A conversão alimentar foi calculada pela relação entre o consumo de ração e o ganho de peso das aves. A viabilidade das aves foi calculada pelo número de aves vivas no início do período menos a mortalidade do período.
As aves foram sacrificadas aos 35 dias de idade por meio de deslocamento cervical. Em seguida, foram submetidas aos procedimentos de sangria, escaldagem, depenagem, evisceração e resfriamento em chiller por 40 minutos. Os órgãos linfóides, baço e bursa, foram coletados durante a evisceração, secos em papel-toalha e pesados em balança de precisão. No cálculo dos rendimentos dos órgãos linfóides, dividiu-se o peso do órgão pelo peso
da ave. Coletaram-se ainda amostras de sangue de todas as aves para contagem de anticorpos no soro (3 mL) e de leucócitos totais no sangue (± 5 mL em tubos com o anticoagulante etilenodiaminotetracético sal dissódico - EDTA).
Para sorologia, as amostras foram coletadas sem anticoagulante e mantidas a temperatura ambiente (± 25ºC) por 3 horas. Os soros separados foram centrifugados em centrífuga Costar mini centrifuge a 8.000 g por 7 minutos. Em seguida, foram congelados a -20ºC em tubos de 1,5 mL e analisados no Laboratório de Virologia da Faculdade de Veterinária da UFRGS.
Na análise de anticorpos, estabeleceu-se um protocolo de ELISA, baseado em outros trabalhos, utilizando-se albumina sérica bovina como antígeno (Parmentier et al., 1994; Bar-Shira et al., 2002; Gutierro et al., 2002). Os soros das aves foram analisados individualmente em duplicata e os resultados foram as médias das densidades óticas determinadas em comprimento de onda de 495 nm em espectrofotômetro Titertek Multiscan MC.
As contagens total e diferencial de leucócitos para medir a relação heterófilo:linfócito foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFRGS utilizando-se esfregaços sangüíneos corados com corante de “Wright”.
Os dados de hematologia, peso relativo de órgãos linfóides e desempenho foram analisados pelo GLM do programa SAS (2001). Na presença de um F significativo, foi usado o Lsmeans para testar as diferenças entre as médias. Os dados de sorologia, em virtude da falta de distribuição normal, foram transformados por meio de Box-Cox. Efetuou-se também o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados foram semelhantes aos obtidos com a transformação e análise de variância, um bom indicativo da consistência analítica.
Resultados e Discussão
Não houve interação (P> 0,05) dos fatores estudados tanto para desempenho e quanto para imunidade. Portanto, serão discutidos apenas os efeitos principais, ou seja, as respostas relacionadas ao ambiente e aos suplementos vitamínico-minerais utilizados.
A inoculação com BSA não teve efeito (P> 0,05) sobre o desempenho das aves durante o período de 1 a 35 dias. Durante a resposta imune, alterações importantes acontecem no metabolismo de energia, aminoácidos, lipídios e minerais-traço (Humphrey & Klasing, 2004), que dependem fundamentalmente do antígeno utilizado e do tipo de resposta imune desencadeada (inata ou adaptativa), portanto, a resposta imune inata produz efeitos mais evidentes que a adaptativa. Antígenos protéicos purificados, como a BSA, estimulam a resposta imune adaptativa, sobretudo a produção de anticorpos, e têm pouco ou nenhum efeito sobre a resposta imune inata, na qual ocorre a liberação de citocinas pró-inflamatórias, que, em grande quantidade, são responsáveis pela redução no desempenho. A BSA, por ser um antígeno timo-dependente, requer a presença de linfócitos TH para induzir a produção de anticorpos. A função efetora dos linfócitos TH consiste na produção de vários tipos de citocinas em quantidades dependentes da forma de apresentação do antígeno e dos sinais co-estimuladores recebidos pelas células TH.
O tipo de dieta influenciou o consumo de ração (P £0,007) e a conversão alimentar (P£0001); a dieta controle (D1) proporcionou o maior consumo de ração e a pior conversão alimentar (Tabela 3). As aves em EPC tiveram menor ganho de peso (P£0,0001) e menor consumo de ração (P£0,0001) em comparação àquelas em ATN, o que era previsível, uma vez que esses resultados são referenciados em vários trabalhos na literatura (Czarick & Tison, 1990; Smith, 1993; Bonnet et al., 1997; Plavnik & Yahav, 1998; Temim et al., 2000; Laganá & Ribeiro, 2007).
Não foi observada diferença significativa entre os tratamentos (P> 0,05) para a variável viabilidade no período de 1 a 35 dias de idade. Por ser um antígeno protéico purificado, assim como hemácias de ovinos, a BSA estimula a resposta imune adaptativa, mas praticamente não têm efeito sobre o sistema imune inato (Humphrey & Klasing, 2004), responsável pela produção de citocinas pró-inflamatórias, que ocasionam as alterações mais evidentes de uma resposta imune, como redução de consumo, febre e alterações na homeostase metabólica (Humphrey & Klasing, 2004), que podem contribuir para o aumento da mortalidade.
Como o calor ocorreu de forma cíclica, as aves puderam se adaptar consumindo menos durante os períodos de alta temperatura, o que refletiu em menor consumo de ração sem alterar as taxas de mortalidade. Teeter et al. (1984) observaram que aumento no consumo de ração em frangos em estresse por calor reduziu a sobrevivência em 14%. Cooper & Washburn (1998) e Laganá & Ribeiro (2007) demonstraram que a exposição de frangos a temperaturas de 32ºC durante algumas horas do dia não influenciou a mortalidade.
Em virtude da transformação realizada nos dados, os valores de produção de anticorpos observados aos 35 dias de idade se tornaram negativos e aqueles mais próximos de zero foram interpretados como superiores (Tabela 3). As aves inoculadas com BSA apresentaram maior nível de anticorpos em comparação àquelas sem BSA (P£0,0001), portanto, apresentaram resposta ao antígeno utilizado. A quantidade de anticorpos não diferiu significativamente entre os tipos de suplementação vitamínico-mineral, porém, houve diferenças em relação ao ambiente. As aves em EPC produziram mais anticorpos contra BSA que aquelas em ATN, independentemente do tipo de suplementação (P< 0,044). A maior produção de anticorpos no ambiente quente contrariam informações de Zulkifli et al. (1994) e Thaxton & Siegel (1970, 1972,1973), que indicaram redução na produção de anticorpos com o aumento da temperatura de criação. Regnier et al. (1980) e Donker et al. (1990) encontraram resultados que indicam não haver efeito redutor do estresse por calor sobre a produção de anticorpos.
Ressalta-se que cada fonte de estresse pode afetar o organismo do animal de forma diferente e, principalmente, as respostas imunológicas podem ser inconsistentes, especialmente quando há grande variação individual, como nas linhagens comerciais, em razão da grande heterozigose.
Segundo Heckert et al. (2002), muitas técnicas comumente utilizadas em laboratório para avaliar a imunocompetência são úteis em situações controladas e com aves de cruzamentos entre uma mesma raça, porém, podem apresentar grande variabilidade quando utilizadas em linhagens comerciais sob condições de campo. Essa variabilidade pode ser aumentada quando os parâmetros ambientais superam o nível de termotolerância das aves, como no caso de estresse por calor.
Em condições de estresse por frio, os resultados também são bastante conflitantes. Subba Rao & Glick (1977) observaram aumento na produção de anticorpos com frio de 7ºC. Regnier et al. (1980) relataram pequeno efeito do frio agudo sobre os títulos de anticorpos contra hemácias de carneiro, enquanto Hester et al. (1996) observaram redução na produção de anticorpos após exposição à temperatura de 0 oC apenas em aves alojadas em gaiolas individuais e não naquelas em gaiolas coletivas.
Em alguns trabalhos que indicam apenas respostas positivas da suplementação de vitamina E sobre o sistema imune, foram utilizados níveis mais altos que os deste trabalho; Ferket et al. (1993) observaram maior produção de anticorpos contra hemácias de ovinos com 300 UI vit. E/kg ração.Por outro lado, Leshchinsky & Klasing (2001) observaram aumento na produção de anticorpos contra hemácias de ovino com suplementação de vitamina E em níveis médios (50 UI/kg), mas o mesmo não ocorreu quando níveis superiores foram utilizados (100 e 200 UI/kg). Diferenças nas condições ambientais, na intensidade dos desafios ou a própria variação individual entre as aves podem explicar as respostas encontradas na literatura.
A inoculação com BSA provocou aumento nos pesos absoluto e relativo da bursa (Tabela 4), que, por ser um órgão linfóide primário, responsável pelo desenvolvimento e pela proliferação de linfóctios B, pode ter seu tamanho aumentado após estímulo antigênico. Os pesos de baço não foram influenciados pela inoculação. Segundo Abbas (2000), o baço é considerado um órgão linfóide secundário, por ser importante mas não indispensável para o sistema imune. Alterações no peso do baço podem não ser tão indicativas do perfil imunológico do animal quanto o peso de bursa.
O ambiente influenciou significativamente os pesos absoluto e relativo de baço e bursa, uma vez que as aves em EPC tiveram menores pesos desses órgãos. Rosales et al. (1989) observaram que aves em EPC apresentaram atrofia de timo, bursa e baço. Puvadolpirod & Thaxton (2000) notaram que o peso relativo de baço reduziu 27%, o de bursa em 43% e o de timo em 65% uma semana após injeção de doses de ACTH em frangos de corte de 5 semanas de idade.
Os dados observados nesta pesquisa foram semelhantes aos descritos por Donker & Beuving (1989) e indicam que índices morfométricos bursais são bons indicativos de estresse, que, por sua vez, causa involução nos órgãos
linfóides primários.Embora as aves tenham sido submetidas ao estresse por apenas três semanas, a involução dos orgãos linfóides pôde ser observada mesmo em situação de EPC cíclico.
A suplementação vitamínico-mineral da dieta não influenciou os pesos absoluto e relativo de bursa e baço. Bartlett & Smith (2003) também não encontraram diferenças no peso relativo de órgãos linfóides de frangos em EPC cíclico alimentados com rações suplementadas com 32, 40 e 100 ppm de zinco.
Não foi observada interação significativa entre os fatores analisados para a contagem diferencial de leucócitos (Tabela 5). A inoculação com BSA não provocou diferenças significativas no número de heterófilos e linfócitos totais nem na relação H/L, o que confirma que a inoculação não representou uma causa de estresse para as aves. Por outro lado, o ambiente influenciou o número de heterófilos totais (P £0,088), assim como a relação H/L (P£0,039), pois as aves em EPC apresentaram maior relação H:L em comparação àquelas em ATN. Aves expostas a agentes estressantes de diferente natureza (temperatura, trauma, drogas, patógenos, manejo) têm o sistema nervoso ativado, ocorrendo a liberação de adrenalina e noradrenalina e também de corticosterona, que age para aumentar o suprimento de energia do organismo. Um estresse persistente significa secreção prolongada de corticosterona, o que causa inúmeros prejuízos ao animal, inclusive no sistema imune. Os corticosteróides provocam leucocitose, com neutrofilia e linfopenia, e conseqüente aumento na relação neutrófilo:linfócito (Colditz, 2002). Altan et al. (2000) encontraram resultados semelhantes, com aumento de 34% nos heterófilos de frangos de 42 dias de idade expostos a um EPC agudo de 39ºC por 2 horas. Mitchell et al. (1992) e Laganá & Ribeiro (2007) encontraram relações H/L superiores a 0,62 em frangos durante o transporte por mais de 3 horas e em altas temperaturas, respectivamente.
O número de linfócitos não foi influenciado (P = 0,64) pelo ambiente, embora as aves em EPC tenham apresentado menor número de linfócitos totais, concordando com Macari & Luquetti (2002), que relataram que, em situações de estresse, com a liberação de ACTH, ocorre redução do número de linfócitos circulantes, colaborando para aumentar a relação H/L.
A suplementação com minerais e vitaminas não afetou significativamente o número de heterófilos e linfócitos e a relação H/L. Puthpongsiriporn et al. (2001), no entanto, observaram aumento no número de linfócitos com a suplementação de 65 UI de vit. E/kg de ração, enquanto Campo & Dávila (2000) verificaram que galinhas estressadas pelo calor e alimentadas com rações suplementadas com 1.000 ppm de vitamina C, 250 ppm de vitamina E, 0,5% de triptofano e 250 ppm de niacina apresentaram linfopenia e redução na relação heterófilo: linfócito (0,65 vs 0,43) em relação às aves sem suplementação.
Conclusões
A suplementação de vitaminas E e C e dos minerais orgânicos zinco e selênio não influenciou a produção de anticorpos de frangos de corte desafiados com albumina sérica bovina; no entanto, o estresse por calor provocou maior produção de anticorpos contra esse antígeno. A inoculação com albumina sérica bovina mostrou-se um recurso adequado para avaliar imunidade humoral de frangos, uma vez que as aves responderam com aumento na produção de anticorpos e no tamanho de bursa. Além disso, o desafio, independentemente do ambiente e da dieta, não afetou o desempenho das aves.
Esse artigo foi originalmente publicado em R. Bras. Zootec., v.37, n.4, p.636-644, 2008 | https://www.scielo.br/j/rbz/a/hyyXqzW57FcZdYwRdtjGGKR/?format=pdf&lang=pt. Este trabalho está licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 International License.
