Análise do perfil genético de estirpes de Salmonella Gallinarum isoladas de casos de tifo aviário no Brasil, por meio da técnica de PFGE

Publicado: 13/04/2015
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 Introdução

Salmonella entérica subsp. enterica sorotipo Gallinarum biotipo Gallinarum (SG) é o agente causador do tifo aviário,uma doença sistêmica aguda ou crônica (BARROW & FREITAS NETO, 2011). Esta enfermidade sistêmica é de grande importância econômica por causar redução na produção de ovos e taxas de mortalidade de até 80 % no campo (SHIVAPRASAD, 2000; EZEMA et al., 2009; BARROW & FREITAS NETO, 2011). Conforme dados da organização de Saúde Animal (OIE), o tifo aviário ainda é um problema para a indústria avícola em muitos países da América do Sul, Ásia e África Central (OIE, 2015) Embora no Brasil o tifo aviário tenha sido considerado sob controle, esta doença voltou a ser identificada em granjas de diversas regiões brasileiras, causando prejuízos para o setor avícola e despertando preocupação das autoridades sanitárias do país.

Métodos capazes de discriminar estirpes de Salmonella spp. com base em diferenças no perfil genético estão disponíveis para auxiliar na investigação epidemiológica do tifo aviário. Dentre estes, o método de Eletroforese em gel de Campo Pulsado (PFGE) tem sido considerado padrão ouro para a comparação dos perfis genéticos bacterianos, principalmente devido à sua elevada precisão e reprodutibilidade (BOXRUD et al., 2007; MAGALHÃES et al., 2005; VAN IMMERSEEL et al., 2013). O PFGE permite avaliar alterações ocorridas em toda extensão do genoma, ocasionadas por mutações, inserções e deleções de fragmentos de DNA (TENOVER et al., 1995). Esse método vem sendo empregado na investigação epidemiológica de estirpes de SG envolvidas em casos de tifo aviário em outros países (KWON et al., 2009; SEO et al., 2006; VAN IMMERSEEL et al., 2013). O objetivo do presente estudo foi analisar o perfil genético de 43 estirpes de SG isoladas em casos de tifo aviário ocorridos em diferentes regiões brasileiras por meio do PFGE.

Material e Métodos

O presente trabalho foi realizado na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Campus Jaboticabal. Foram utilizadas 43 estirpes de SG incluindo a estirpe vacinal SG9R. A maioria das estirpes foram isoladas de órgãos de galinhas poedeiras de casos atendidos na rotina do laboratório de Ornitopatologia da FCAV/Unesp e, posteriormente, tipificadas pelo Instituto Adolfo Lutz. Entretanto. Outras estirpes foram cedidas por laboratórios nacionais de referência ou credenciados (Lanagro, Fiocruz e Mercolab). As estirpes foram isoladas de aves com tifo aviário nos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais e Mato Grosso em diferentes épocas. Enquanto que a estirpe padrão (ATCC 9184) é proveniente do “American Type Culture Collection”. Todas as estirpes são estocadas em ultrafreezer a -80 °C, no laboratório de ornitopatologia da FCAV/Unesp.

Os isolados foram caracterizados pelo protocolo padrão de PFGE da PulseNet, conforme descrito por Ribot et al. (2006) com algumas modificações. O sistema utilizado foi o CHEF DR-III (Bio-Rad, EUA), o DNA cromossomal foi digerido com a enzima Xbal (Sigma) e a electroforese foi realizada em gel de agarose Pulse field Certified 1 % (Bio-Rad, EUA) submetidos à voltagem de 6 V cm-1, em um angulo de 120º, com tempo inicial de mudança de polaridade de 2,2 segundos e tempo final de mudança de polaridade de 54,2 segundos. A estirpe de Salmonella Braenderup (H9812) foi utilizada como padrão para o método e os géis submetidos à electroforese por 21h a uma temperatura de 14 ºC. Os padrões das bandas foram comparados utilizando-se o coeficiente de Dice a 1 % de tolerância e 0,5 % de optimização. O dendograma foi calculado com o método de agrupamento UPGMA (Unweighted-pair group method using arithmetic averages algorithm), utilizando o software BioNumerics, versão 7.1 (Matemática aplicada, Sint-Martens-Laten, Bélgica).

Resultados e Discussão

A Figura 1 contém o dendrograma obtido pela submissão das estirpes de SG ao PFGE. Foi possível reunir as estirpes em dois grandes grupos (A-B). Para isso foi traçada uma linha considerando o nível de 70 % de similaridade genética entre as estirpes.

Figura 1 Dendrogramacom padrões de bandas obtidas pelo PFGE aplicado em isolados de S. Gallinarum.

No grupo A observou-se associação entre o perfil genético das estirpes e a região de isolamento, sendo a maioria isoladas nos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul.

O perfil B inclui 35 estirpes, isoladas nos estados de SP, MG e de estados da região sul. Aquelas com mais de 70 % de similaridade foram agrupadas em subgrupos (B1, B2, B3, B4, B5, B6). Alguns destes isolados apresentaram perfis genéticos muito semelhantes. Por exemplo, observou-se no subgrupo B1 uma proximidade genética entre a estirpe 43 (SG9R) e as estirpes 08 e 09 (isoladas de surtos de tifo aviário). De acordo com Van Immerseel et al. (2013), estirpes com fenótipo patogênico podem ser originadas da estirpe SG9R após a aquisição de mutações. Neste contexto, seria possível que o mesmo tenha ocorrido com as estirpes 08 e 09 do presente estudo.

As estirpes pertencentes aos subgrupos B2, B3 e B4 foram isoladas no estado de São Paulo. Sendo que o subgrupo B4 é composto por estirpes (38, 40 e 41) com perfil genético idêntico, acredita-se que sofreram pouca ou nenhuma alteração genética. É possível que sejam oriundas de um único clone responsável por um surto que, posteriormente, tenha se disseminado e originado outros surtos de tifo aviário. Devido a diversidade genética, algumas das estirpes do grupo B (35, 19, 15, 31, 28, 32, 16, 21, 3, 26 e 12) não foram subagrupadas.

Mesmo com a modernização da indústria avícola brasileira e adoção de medidas de controle, o tifo aviário ainda causa muitos prejuízos para o setor. Provavelmente, falhas nos programas de controle tenham favorecido a ressurgência do tifo aviário no Brasil. A experiência de outros países demonstrou que a monitoria seguida de destruição de lotes portadores seria uma forma de reduzir a ocorrência do tifo aviário nas propriedades avícolas (COGAN & HUMPHREY, 2003). Programas de vacinação também podem apresentar bons resultados na redução da enfermidade (Kwon et al., 2009), porém são ineficazes na ausência de outros componentes do programa de biosseguridade como limpeza e desinfecção das instalações, controle de pragas e correto descarte de aves mortas (DAVIES & BRESLIN, 2003).

Conclusões

Com base nos dados do presente estudo é possível afirmar que existe uma diversidade genética de estirpes de SG isoladas no território brasileiro. Há uma tendência de circulação de estirpes com perfis genéticos semelhantes restritas ao mesmo estado ou região.

Agradecimentos

Conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico.

Referências Bibliográficas

BARROW, P. A.; FREITAS NETO, O. C. Pullorum disease and fowl typhoid-new thoughts on old diseases: a review. Avian Pathology, Abingdon, v. 40, n. 1, p. 1-13, 2011.

BOXRUD, D.; PEDERSON-GULRUD, K.; WOTTON, J.; MEDUS, C.; LYSZKOWICZ, E.; BESSER, J.; BARTKUS, J. M. Comparison of Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis, Pulsed-Field Gel Electrophoresis, and Phage Typing for Subtype Analysis of Salmonella enterica Serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, n. 2, p. 536–543, 2007.

COGAN, T. A.; HUMPHREY, T. J. The rise and fall of Salmonella Enteritidis in the UK. Journal Applied of Microbiology. Bristol, v. 94, n. 1, p. S114-S119, 2003.

DAVIES, R. H.; BRESLIN, M. Persistence of Salmonella enteritidisphage type 4 in the environment and arthropod vectors on an empty free range chicken farm. Environmental Microbiology. Addlestone, v. 5, n. 2, p. 79–84, 2003.

EZEMA, W. S.; ONUOHA, E.; CHAH, K. F. Observations on an outbreak of fowl typhoid in commercial laying birds in Udi, South Eastern Nigeria. Comparative Clinical Pathology, v. 18, p. 395-398, 2009.

KWON, Y. K.; KIM, A.; KANG, M. S.; HER, M.; JUNG, B. Y.; LEE, K. M.; JEONG, W.; AN, B. K.; KWON, J. H. Prevalence and characterization of Salmonella Gallinarum in the chicken in Korea during 2000 to 2008. Poultry Science. v. 89, n. 2, p. 236-242, 2009

MAGALHÃES, V. D.; FERREIRA, J. C.; BERELLI, C.; DARINI, A. L. Eletroforese em campo pulsante em bacteriologia - uma revisão técnica. Revista do Instituto Adolfo Lutz. v. 64, n. 2, p. 155-161, 2005.

OIE, The World Organization for Animal Health. World Animal Health Information Database. Disponível em: http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/the-world-animal-health-information-system/the-oie-data-system/

RIBOT, E.M.; FAIR, M.A.; GAUTOM, R.; CAMERON, D.N.; HUNTER, S.B.,; SWAMINATHAN, B.; BARRETT, T.J. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtypingof Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease v.3, n. 1, p. 59–67, 2006.

SEO, Y. S.; LEE, S. H., SHIN, E. K., KIM, S. J., JUNG, R., HAHN, T. W. Pulsed-field gel electrophoresis of Salmonella gallinarum and comparison with random amplified polymorphic DNA. Veterinary Microbiology, v. 115, p. 349-357, 2006.

SHIVAPRASAD, H. L. Fowl typhoid and pullorum disease.Revue Scientifiqueet Technique Office International Epizooties v. 19, n. 2, p. 405-424, 2000.

TENOVER, F. C., R. D. ARBELIT, R. V. GOERING, P. A. MICKELSEN, B. E. MURRAY, D. H. PERSING, AND B. SWAMINATHAN. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing.Journal of Clinical Microbiology, v. 33, p. 2233–2239, 1995.

VAN IMMERSEEL, F. STUDHOLME, D. J. ,EECKHAUT, V., HEYNDRICKX, M, DEWULF,J., DEWAELEC, I., VAN HOOREBEKE,S., HAESEBROUCK, F., VAN MEIRHAEGHE, H., DUCATELLE, R., PASZKIEWICZ, K., TITBALL R. W. Salmonella Gallinarum field isolates from laying hens are related to the vaccine strain SG9R. Vaccine, 2013. Disponível em: http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.08.033

***O trabalho foi originalmente apresentado durante o XIII Congresso da APA – Produção e Comercialização de Ovos, “Ovo todos os dias: só faz bem!”, em Ribeirão Preto, entre os dias 17 e 19 de março.

 
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