EFEITO DE DILUENTES DE CURTA E LONGA DURAÇÃO NA QUALIDADE DO SÊMEN SUÍNO RESFRIADO

 

Na suinocultura mundial, mais de 99% das inseminações artificiais são realizadas com sêmen diluído e refrigerado, de modo que a preservação dos espermatozoides após a ejaculação é altamente influenciada pela composição do diluente utilizado (JOHNSON et al., 2000). Os tampões e estabilizantes de membrana são os principais componentes que determinam a duração do diluente de acordo com o período em que a viabilidade espermática é mantida (GADEA, 2003). Para diluentes de curta, média, longa ou extralonga duração, esse período é de até três, cinco, sete ou de oito ou mais dias de armazenamento, respectivamente. O tipo de diluente parece influenciar a motilidade e a qualidade espermática de doses inseminantes, como já descrito para diversos diluentes disponíveis comercialmente (DUBÉ et al., 2004; AMBROGI et al., 2006; PINART et al., 2015). O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de dois diluentes comerciais de curta e longa duração (BTS e Androstar® Plus) nos parâmetros de motilidade, integridade de acrossoma e viabilidade espermática, em doses de sêmen suíno armazenadas por até sete dias.

 

Foram utilizados ejaculados provenientes de 28 reprodutores suínos (AGPIC® 337, Agroceres) para a produção de doses inseminantes em split sample em dois diluentes: BTS (Beltsville Thawing Solution, Minitüb GmbH) e Androstar® Plus (Minitüb GmbH). As doses foram produzidas com 45 ml e 1,5 bilhão de espermatozoides totais e envasadas em flexitubos (Flexitube®, Minitüb GmbH). As doses foram armazenadas em uma conservadora à temperatura média de 17,8ºC ± 0,49 e homogeneizadas manualmente uma vez por dia. Análises de motilidade e cinética espermática foram realizadas nas horas 0, 24, 72, 120 e 168 enquanto que a integridade de acrossoma e viabilidade espermática foram avaliadas nas horas 0, 72 e 168. Para as análises de motilidade espermática, 1 ml de cada dose foi incubado a 38ºC por 10 min e 3 μl foram dispostos em câmara de contagem (Leja® 20 ara avaliação no sistema CASA (Computer-Assisted Semen Analysis, AndroVision®, Minitüb GmbH). A integridade de acrossoma foi determinada pela avaliação de 200 células espermáticas quanto à presença de acrossoma íntegro ou danificado, utilizando microscópio de contraste de fase (aumento 1000x). A viabilidade espermática foi avaliada usando a sonda fluorescente SYBR14/PI (LIVE/DEAD Sperm Viability kit, Invitrogen™). Uma alíquota de cada dose foi incubada com o corante por 15 minutos a 38ºC ao abrigo da luz e, após, 200 espermatozoides foram avaliados quanto à integridade de membrana sob microscopia de fluorescência (objetiva 40x). As variáveis foram analisadas como medidas repetidas, com o uso do PROC MIXED do SAS 9.3 (Statistical Analysis System, 2011) e os valores do momento zero foram mantidos no modelo como covariável, quando significativos (P≤0,05). As médias (LSmeans) dos diluentes ou dos momentos de avaliação foram comparadas pelo teste de Tukey-Kramer ao nível mínimo de significância de 5%.

 

As doses inseminantes produzidas em diluente Androstar® Plus apresentaram motilidade total e motilidade progressiva superiores ao BTS em todos os momentos avaliados ao longo do armazenamento (Figura 1). A diferença de motilidade entre os diluentes se acentuou ao longo do período de armazenamento, de modo semelhante ao observado por Ambrogi et al. (2006). A maioria dos parâmetros de cinética espermática avaliados pelo sistema CASA também diferiu entre os dois diluentes, com valores superiores nas doses diluídas em Androstar® Plus (Tabela 1). Houve interação entre diluente e momento de avaliação para DCL (distância percorrida em linha curva) e ALH (amplitude de deslocamento lateral da cabeça), sendo observados maiores valores para o diluente Androstar® Plus a partir de 72 h para DCL e de 120 h para ALH.

 

Figura 1 - Motilidade total e motilidade progressiva de espermatozoides suínos em diluente Androstar® Plus e BTS. * indica diferença significativa entre os diluentes ao longo do armazenamento (P≤0,05).

 

Tabela 1 – Cinética espermática de doses de sêmen diluídas em Androstar® Plus e BTS ao longo de 168 h de armazenamento.

EPM: Erro Padrão da média; BCF: frequência com que o traçado real cruza o traçado médio; DAP: distancia percorrida do traçado médio; DSL: distância percorrida em linha reta; VAP: velocidade do trajeto médio; VSL: velocidade em linha reta; VCL: velocidade em linha curvilínea; LIN (Linearidade): VSL/VCL; WOB (Wobble): VAP/VCL.

 

Em outros estudos, também foram verificadas diferenças significativas entre diluentes de curta e longa duração (BTS e Androhep® Plus) na motilidade total e progressiva (DUBÉ et al., 2004) e entre diluentes de curta e extralonga duração (BTS e Duragen®) quanto à motilidade progressiva e parâmetros de cinética espermática durante o armazenamento (PINART et al., 2015). As principais diferenças entre os diluentes podem ser atribuídas aos componentes adicionais dos diluentes de ação prolongada, que asseguram melhor controle de pH e proteção de membranas.

 

A maior porcentagem de espermatozoides com acrossomas íntegros foi observada nas doses com Androstar® Plus em relação ao BTS, em ambos os momentos de avaliação, 72 h (97,6% vs. 97,1%; P<0,001) e 168 h (96,0% vs. 93,4%, P<0,0001). O percentual de membranas espermáticas viáveis foi de 82,8% no Androstar® Plus e 80,0% no BTS, com diferença significativa entre os diluentes (P<0,01). Esses resultados demonstram uma melhor preservação da integridade do acrossoma e da membrana espermática pelo diluente de ação prolongada, semelhante ao observado em outros estudos (WATERHOUSE et al., 2004; PINART et al., 2015).

 

O diluente Androstar® Plus é mais eficiente em preservar os parâmetros espermáticos de motilidade, integridade de acrossoma e viabilidade espermática em relação ao BTS, mesmo em curto período de armazenamento. O diluente BTS manteve a motilidade espermática em padres satisfatórios até três dias de armazenamento, sem uma diferença acentuada em relação ao Androstar® Plus, até o quinto dia de armazenamento.

 

1. AMBROGI DE, M.; BALLESTER, J.; SARAVIA, F.; et al., 2006. Effect of storage in short- and long-term commercial semen extenders on the motility, plasma membrane and chromatin integrity of boar spermatozoa. International Journal of Andrology, (29): 543-552.

2. DUBÉ, C.; BEAULIEU, M.; REYES-MORENO, C.; et al., 2004. Boar sperm storage capacity of BTS and Androhep Plus: viability, motility, capacitation, and tyrosine phosphorylation. Theriogenology, (62): 874–886.

3. GADEA, J., 2003. Review: Semen extenders used in artificial insemination of swine. Spanish Journal of Agricultural Research, (1): 17-27.

4. JOHNSON, L.A.; WEITZE, K.F.; FISER, P.; et al., 2000. Storage of boar semen. Animal Reproduction Science, (62): 143–172.

5. PINART, E.; YESTE, M.; PRIETO-MARTÍNEZ, N.; et al., 2015. Sperm quality and fertility of boar seminal doses after 2 days of storage: Does the type of extender really matter? Theriogenology, (83): 1428-1437.

6. WATERHOUSE, K.E.; DE ANGELIS, P.E.; HAUGAN T.; et al., 2004. Effects of in vitro storage time and semen-extender on membrane quality of boar sperm assessed by flow cytometry. Theriogenology, (62): 1638–1651.