UTILIZAÇÃO DA REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA NA IDENTIFICAÇÃO DE Clostridium difficile EM SUÍNOS
Publicado: 5 de outubro de 2016
Por: LÍVIA BOARINI1, DANIELE A. PEREIRA2, MARIANA VALLI GOMES1, RUBEN PABLO SCHOCKEN-ITURRINO1, LUÍS GUILHERME DE OLIVEIRA2.
1Laboratório de Bactérias Anaeróbicas/Departamento de Patologia Veterinária - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP– Jaboticabal/SP,
2Laboratório de Pesquisa em Suínos/DCCV -Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP– Jaboticabal/SP –
Sumário
Em virtude de aprofundar os estudos sobre a transmissão de C. difficile em suínos, este estudo objetivou avaliar a transmissão pela via aérogena em suínos confirmando-a pela PCR. O experimento contou com seis leitões, onde quatro foram inoculados com placebo, e dois com inóculo de C. difficile. Os leitões foram dispostos em três grupos em baias isoladoras para bioensaios e permaneceram por 21 dias. Suabes anorretais dos três grupos foram coletados e submergidos em tubos com BHI caldo enriquecido com 0,5% de extrato de levedura e cisteína, submetidos a choque térmico e incubados a 37ºC por 48h em anaerobiose. Foi extraído o DNA e realizada reações de PCR para a detecção dos genes das toxinas alfa e beta. Nos resultados, observou-se diarreia em apenas um leitão do grupo infectado, embora as análises em laboratório confirmaram positividade nos dois leitões. Na literatura há vários estudos afirmando que C. difficile foi recuperado em animais que não apresentavam nenhum sinal clínico da doença. As amostras coletadas do grupo controle e centinela apresentaram crescimento bacteriano, mas após a triagem pela PCR comprovou-se que estes grupos estavam negativos para o patógeno. Os resultados negativos são satisfatórios por assegurar que a transmissão por correntes de ar não contribuem para o processo de infecção. Conclui-se que não houve transmissão horizontal de Clostridium difficile pela via aérogena em suínos utilizando a PCR como método de identificação dos genes das toxinas A/B.
Palavras-chave: aerógena; leitões; transmissão.
Introdução
A suinocultura é considerada uma das atividades agropecuárias mais difundidas no mundo e umas das principais fontes de proteína animal. O Brasil tem investido na área de sanidade e biossegurança, seguindo padrões internacionais e mantendo-se como referência em produção e exportação de carne.
Alguns grupos de bactérias, dentre eles a espécie Clostridium difficile tem sido reportada como importante causadora de diarreias em leitões neonatos, caracterizando infecção nos animais até o sétimo dia de nascimento. YAEGER et al. (2002) relata que esta bactéria é transmitida pela via fecaloral e considerada o principal meio de infecção.
JACOBSON et al. (2005) afirmam que as infecções bacterianas são assiduamente observadas nas granjas e causam grande impacto negativo. A presença desse microrganismo interfere no desempenho e rendimento dos animais, com atrasos no crescimento, redução da eficiência alimentar e gastos com tratamentos. Além disso, é responsável por 30% das perdas econômicas (BURCH, 2000) e ameaça à saúde pública.
O diagnóstico é realizado pela detecção das toxinas (A e B) e isolamento da bactéria em meio de cultura específico, essas toxinas agem danificando o epitélio do cólon desencadeando a enfermidade (BARBOSA et al., 2010). A frequência e o conhecimento da infecção por Clostridium difficile no Brasil são pouco elucidados, já que há estudos escassos sobre esse patógeno na área veterinária, tornando grande problema em infecções nos animais e problema econômico para produtores.
Em virtude disso, torna-se de extrema importância aprofundar os estudos com relação aos meios de transmissão de C. difficile em suínos, assim como a elaboração de métodos de controle desses microrganismos nos sistemas de produção. O objetivo deste estudo foi avaliar a transmissão horizontal de Clostridium difficile pela via aérogena em suínos, confirmando a transmissão pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).
Material e Métodos
Foram adquiridos seis leitões de uma mesma leitegada de granja sob rígido controle sanitário, e foram realizadas análises prévias para confirmar a ausência de Clostridium spp. E C. difficile nos leitões durante um período de quarentena (7 dias). O delineamento experimental, análises microbiológicas e moleculares ocorreram na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal – SP.
Os leitões foram separados e dispostos aleatoriamente em dupla, formando três grupos (controle, infectado e sentinela) e alojados em baias isoladoras previamente limpas e desinfetadas, especialmente projetadas para bioensaios. O sistema foi disposto em linha horizontal, favorecendo a circulação de ar em todas as baias, onde havia filtros HEPA na entrada e saída de ar do sistema.
O inóculo foi preparado com cepa padrão de C. difficile VPI 10463 cedida pela Universidade de São Paulo (USP) em concentração de 106 UFC/mL. O inoculo foi instilado lentamente na região da faringe com auxílio de seringa estéril, e após os leitões foram alojados nas baias isoladoras. Os animais do grupo controle e sentinelas foram submetidos ao mesmo procedimento, porém com a inoculação de placebo (caldo BHI estéril). Ressalta-se que os leitões estavam em jejum alimentar e hídrico 18 horas antes da inoculação e 30 minutos após.
A permanência dos animais no sistema isolador ocorreu no período de 21 dias, onde água e ração eram fornecidas sem antibióticos e esterilizadas, e todo sistema manteve-se monitorado a fim de excluir eventos ambientais e alterações externas.
Durante o período de isolamento, amostras de suabes anorretais dos três grupos foram coletadas para avaliar a excreção de C. difficile pelas fezes. Para isso, os suabes coletados foram submergidos em tubos com BHI caldo enriquecido com 0,5% de Extrato de Levedura e cisteína e submetidos a choque térmico de 80°C por 10 minutos, a fim de eliminar células vegetativas e contaminantes, e favorecer a germinação dos esporos. Os tubos foram incubados a 37ºC por 48 horas com sistema anaeróbico.
Após esse período, as amostras foram submetidas à extração de DNA pelo método de fervura. A partir do DNA das amostras realizou-se reações de PCR para a detecção dos genes que codificam as toxinas alfa e beta presentes no C. difficile com temperatura de anelamento de 50ºC. As cepas de Clostridium difficile utilizadas como padrão positivo foram as mesmas utilizadas para o preparo do inóculo.
Resultados e Discussão
Foi observado diarreia em apenas um leitão do grupo infectado, porém com as análises em laboratório, foi confirmado que os dois leitões do grupo infectado foram positivos para o patógeno. Esse fato pode ser explicado em várias pesquisas na literatura, as quais afirmam que C. difficile foi recuperado em animais que não apresentavam nenhum sinal clínico de doença (Barbosa et al., 2010; Schneeberg et al., 2013). A amostras coletadas do grupo controle e sentinela, após a triagem pela PCR, comprovou-se que estes grupos estavam negativos para o patógeno.
Nesta pesquisa, confirmamos que a via de transmissão aerógena não viabilizou infecção entre os grupos durante o período de isolamento dos leitões. Não houve positividade, segundo a técnica de PCR, na identificação dos genes das toxinas A/B de C. difficile VPI 10463 no grupo sentinela, caracterizando a ausência de transmissão para este grupo. A utilização desta técnica molecular ocorreu pois é amplamente conhecida e segura para tais análises, além de proporcionar resultados rápidos e sensíveis para um diagnóstico preciso.
O C. difficile tem se tornado grande entrave com prejuízos no setor suinícola devido sua disseminação no ambiente, graves ocorrências de enfermidade e óbito na maternidade dos leitões. Os resultados negativos são satisfatórios por assegurar que a transmissão por correntes de ar não contribui para o processo de infecção. Até o momento, ainda não foi possível elucidar outra via de transmissão de C. difficile diferente da fecal-oral, e esses resultados são importantes para a manutenção e controle da disseminação do patógeno em granjas e confinamentos de suínos, o qual é encontrado com grande prevalência e sua transmissão entre os animais é preocupante.
Susick et al. (2012) isolaram C. difficile em todas as etapas de criação de suínos, a frequência variou entre as etapas, mas os resultados apresentados permitem visualizar o problema e incluir tentativas de controle e eliminação desse patógeno na indústria, já que sua disseminação se mostra alta na produção e criação de suínos.
Nossa pesquisa é de grande valia para a prevenção e controle na disseminação desse patógeno, já que a via aerógena não se mostrou eficaz na transmissão, e até o momento, a via fecal-oral é a única forma de transmissão conhecida desse patógeno, com isso, pode-se controlar a doença mantendo o ambiente de confinamento higienizado e livre de dejetos.
Conclusões
Concluímos neste estudo que não houve transmissão horizontal de Clostridium difficile pela via aérogena em suínos utilizando a técnica molecular PCR como método de identificação dos genes das toxinas A/B.
Referências Bibliográficas
1. BARBOSA, C.G; DUGAICH, B.; BIERHALS, T.; ZUFFO, P.; HENN, P.K.V.K.; VAZ, E.K.F. 2010. Ocorrência de Clostridium difficile em leitões submetidos à antibioticoterapia nas regiões de Santa Catarina. Ci. Anim. Bras. v.11, n.4, p.874-879.
2. BURCH, D. G. S. 2000. Controlling diarrhoea in growing pigs – the grey scour syndrome. Pig Journal. v.45, p.131-149.
3. JACOBSON, M.; LÖFSTEDT, M. G.; HOLMGREN, N.; LUNDEHEIM, N.; FELLSTRÖM, C. 2005. The prevalence of Brachyspira spp. and Lawsonia intracellularis in swedish piglet producing herds and wild boar population. Journal of Veterinary Medicine. B, Infectious.
4. SCHNEEBERG, A.; NEUBAUER, H.; SCHMOOCK, G.; BAIER, S.; HARLIZIUS, J.; NIENHOFF, H.; BRASE, K.; ZIMMERMANN, S.; SEYBOLDT, C. 2013. Clostridium difficile Genotypes in Piglets Populations in Germany. Journal of Clinical Microbiology. v.51, n.11, p.3796-3803.
5. SUSICK, E. K.; PUTNAM, M.; BERMUDEZ, D. M.; THAKUR, S. 2012. Longitudinal study comparing the dynamics of Clostridium difficile in conventional and antimicrobial free pigs at farm and slaughter. Veterinary Microbiology. v.157, p.172-178.
6. YAEGER, M.; FUNK, N., HOFFMAN, L. 2002. A survey of agentes associated with neonatal diarrhea in Iowa swine including Clostridium difficile and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Vet. Diagn. Invest. v.14, p.281–287.
***O TRABALHO FOI ORIGINALMENTE APRESENTADO DURANTE O XVII CONGRESSO ABRAVES 2015- SUINOCULTURA EM TRANSFORMAÇÂO, ENTRE OS DIAS 20 e 23 DE OUTUBRO, EM CAMPINAS, SP.
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