USO DE FLUIDO ORAL DE SUÍNOS PARA ISOLAMENTO DE ENTEROBACTÉRIAS

 

Recentemente descrita, a coleta de fluido oral é apresentada como alternativa para a busca de anticorpos e patógenos, com sensibilidade semelhante aos métodos tradicionais e menores impactos ao bem-estar animal no momento da coleta. Fluido oral é uma mistura de saliva, produzida pelas glândulas salivares maiores e menores, e transudato das mucosas gengival e bucal, contendo anticorpos derivados do soro sanguíneo (Prickett et al., 2008) e microbiota advinda do ambiente, alimentos e água. A coleta de fluido oral é usualmente realizada através da utilização de uma corda de três fios, de algodão, com 1,27 cm de diâmetro e com a extremidade inferior distante 60 cm do chão da baia (White et al., 2012). Os suínos, por curiosidade, instintivamente mascam a corda de algodão, que devido a seu potencial absortivo de líquidos, retém o fluido oral (Olsen et al., 2012) e é indicada a utilização de uma corda para cada dez animais (Trombani et al., 2012). Seguindo os protocolos acima descritos, as amostras representam os animais da baia, e não os indivíduos. De acordo com Zanella (2015), é possível obter amostras de indivíduos utilizando roletes de algodão hidrofílico. Dessa forma, as análises devem ser mais representativas das variações individuais dos animais dentro de um mesmo lote. Os principais indicadores da qualidade higiênico-sanitária de alimentos são os membros da família Enterobacteriaceae, sendo Escherichia o gênero típico da família (Silva et al., 2010). As enterobactérias são amplamente distribuídas, podendo também ser encontradas no solo, água, frutas, vegetais, animais e nos seres humanos, sendo relacionadas a 50% das infecções nosocomiais (Holt et al., 1994). O envolvimento de produtos cárneos na ocorrência das doenças de origem alimentar se dá pelo fato que muitos dos agentes potencialmente patogénicos pertencem a microbiota natural dos animais de corte (trato digestório, narinas, faringe, cavidade bucal, tonsilas e tecido linfático) e contaminam as carcaças durante o abate, ou acabam sendo transportados do ambiente contaminado para as mesmas, pelo manipulador, utensílios, equipamentos ou mesmo a água (Matsubara, 2005). De acordo com Borch et al. (1996), os animais são os principais geradores da carga microbiana de um produto cárneo, a partir do conteúdo gastrointestinal, pele, pelos e região orofaríngea. Segundo Côrtes (1993), a via oral e a mucosa do aparelho digestório são definidas como portas de entrada na cadeia epidemiológica, sendo os pontos de penetração mais frequentemente utilizados por agentes veiculados por alimentos. O monitoramento da presença de agentes patogênicos nos rebanhos é um dos elos da cadeia de segurança dos alimentos, e a obtenção de amostras biológicas é um dos principais obstáculos encontrados pela difícil contenção de indivíduos nas produções suínas, principalmente quando em lotes nas fases de creche, crescimento e terminação (Gay, 2002; Sobestiansky et al., 2007). A utilização de fluido oral como amostra biológica para a realização de testes para diagnóstico (seja ELISA, PCR ou RT-PCR) já foi descrita como eficiente para Erysipelothrix rushiopathiae (Opriessnig et al., 2012), Vírus da Influenza A (Panyasing et al., 2012), Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína e Circovírus Suíno 2 (van Hout et al., 2012). Até o presente momento, encontramos apenas uma publicação que fez uso de fluido oral para isolamento bacteriano, utilizando animais infectados experimentalmente com E. rushiopathiae (Opriessnig et al., 2012). Considerando-se que a boca é uma das principais portas de entrada para patógenos, espera-se que uma grande diversidade de agentes seja encontrada, e ainda que o monitoramento de contaminação de carcaças ocorre no fim da cadeia produtiva, então entendemos que a detecção precoce de potenciais agentes patogênicos e contaminantes de carcaças ainda no rebanho possa direcionar as ações preventivas no momento do abate. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi a detecção direta de enterobactérias (E. coli, Salmonella spp, Shigella spp. e Pseudomonas spp.) a partir de fluido oral de suínos, utilizando meios seletivos e provas bioquímicas para o isolamento e identificação bacteriana.

 

Foram utilizados roletes de algodão hidrofílico presos a fio resistente, autoclavados em tubos de fundo cônico com tampa com capacidade para 15 ml (tipo falcon). Na granja, o rolete foi oferecido aos suínos individualmente, e após mastigação voluntária, estes foram armazenados nos tubos e mantidos em caixas isotérmicas com gelo até a chegada ao laboratório (Zanella, 2015). Foram colhidas 31 amostras de fluído oral, água, ração e/ou meio ambiente, sendo distribuídas da seguinte forma: (1) cinco amostras da baia de crescimento/terminação (três animais com ≈70 dias de idade); (2) cinco amostras da baia de crescimento/terminação (três animais com ≈110 dias de idade); (3) seis amostras da baia de maternidade (três animais com ≈10 dias de idade); (4) seis amostras da baia de maternidade (três animais com ≈21 dias de idade); (5) nove amostras da baia de creche (seis animais com ≈50 dias de idade). O protocolo de isolamento previa a detecção dos seguintes gêneros bacterianos: E. coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp. e Shigella spp., de acordo com Silva et al. (2010).

 

Todas as amostras apresentaram crescimento bacteriano. As 31 amostras foram colhidas dos animais e ambiente de diferentes baias dos três setores da granja (maternidade, creche e crescimento/terminação), sendo possível isolar E. coli apatogênica de todas as amostras. Ainda, vinte amostras apresentaram isolamento de E. coli potencialmente patogênica. Foi possível recuperar Salmonella spp. de 30 amostras, além de 20 amostras com positividade para Shigella spp., e seis amostras positivas para Pseudomonas ssp. Quando analisamos as amostras apenas dos animais (fluído oral), observamos as seguintes frequências de isolamento bacteriano: E. coli apatogênica (100%), E. coli potencialmente patogênica (55,56%), Salmonella spp. (100%), Shigella spp. (66,67%) e Pseudomonas spp. (22,22%). Isso representa um elevado potencial infeccioso com alto risco para desenvolvimento de quadros clínicos e possível contaminação de carcaças durante os procedimentos de abate. Quanto as amostras de ambiente, ração e água, estas também apresentaram altas frequências de isolamento bacteriano: E. coli apatogênica (100%), E. coli potencialmente patogênica (76,92%), Salmonella spp. (92,31%), Shigella spp. (88,89%) e Pseudomonas spp. (22,22%), demonstrando um elevado potencial contagioso e alto grau de contaminação ambiental. Isso indica também um constante desafio de infecção para os animais, sendo necessário identificar a via de entrada desses patógenos no plantel e se as formas de controle ambiental entre os lotes estão sendo efetivas. A baixa ocorrência de Pseudomonas spp nas amostras de suínos indica que nesta etapa todo o material foi coletado em condições de esterilidade, e considerando que esta bactéria também está distribuída no meio ambiente (Oliveira et al., 2013), nosso procedimento de coleta foi efetivo.

 

Os resultados obtidos comprovam que o fluido oral é uma alternativa viável de material biológico para a identificação e isolamento de enterobactérias (E. coli, Salmonella spp., Shigella spp. e Pseudomonas spp.), permitindo a detecção de potenciais contaminantes de carcaça antes dos animais chegarem a linha do abate. Além disso, a coleta de fluido oral é menos estresante para o suíno, em comparação a coleta de outros materiais biológicos, indo de encontro às diretrizes da suinocultura moderna que prezam pelo bem-estar animal.

 

agradecemos à Pró-Reitoria de Pesquisa da USP pelo oferecimento de bolsa de iniciação científica RUSP 2014-2015 para o aluno Vitor Alexandre Froge.

 

1. Borch, E.; Nesbakkenb, T.; Christensen, H. Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne bacteria. Int J Food Microbiol, 30(1): 9-25, 1996.

2. Cortez, J. A. Epidemiologia. São Paulo: Varela, 1993.

3. Gay, C.C. Exame Clínico de Suínos. In: Exame clínico e diagnóstico em veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.

4. Holt, J.G.; Krieg, N.R.; Sneath, P.H.A.; et al. Facultatively anaerobic gram-negative roads. In: Bergey´s Manual of determinative bacteriology. 9. ed., Baltimore: Williams & Wilkins, 787p.1994.

5. Matsubara, E.M. Condições higiênico-sanitária de meias-carcaças de suínos após o abate e depois do resfriamento e analise da utilização de lista de verificação para avaliar boas práticas no abate de suínos. Dissertação de mestrado, Universidade de São Paulo. FMVZ, SP, 2005.

6. Oliveira, K.M.P.; Júlio, P.D.D.; Grisolia, A.B. Antimicrobial susceptibility profile of Pseudomonas spp. isolated from a swine slaughterhouse in Dourados. Revista Argentina de Microbiología, 45: 57- 60, 2013.

7. Olsen, C., Coetzee, J., Kittawornrat, A., Main, R. Effect of sample collection material on detection of PRRSV antibody in oral fluid. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

8. Opriessnig, T., Giménez-Lirola, L., Halbur, P. Identification of anti-IgG antibodies to Erysipelothrix spp. in a serum samples and oral fluid from experimentally infected pigs. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

9. Panyasing, Y., Irwin, C., Kittawornrat, A., Prickett, J. Adoption of a commercial nucleoprotein blocking ELISA to detection of antibody against influenza A virus in pig oral fluids specimens. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

10. Prickett, J., Simer, R., Christopher-Hennings, J., Yoon, K.-J., Evans, R. B., Zimmerman, J. J. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J Vet Diagn Invest, 20(2):156–163, 2008.

11. Silva, N.; Junqueira, V.C.A.; Silveira, N.F.A.; Taniwaki, M.H.; Santos, R.F.S.; Gomes, R.A.R. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 4. ed. São Paulo: Livraria Varela, 624p., 2010.

12. Sobestiansky, J., Reis, A.T., Reis, R. Monitoramentos sanitários. In: Sobestiansky, J.; Barcellos, D. Doenças de Suínos. Goiânia: Cânone Editorial, 2007.

13. Trombani, C., Liber, M., Herin, J., Perreul, G. Diagnosis of swine influenza virus in porcine oral fluid samples. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

14. van Hout, A., Franssen, P., Wellenberg, G., Plat, B. T. A comparison of oral fluids and blood samples from pigs for the detection of PRRSV and PVC2 by PCR and antibody ELISA. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

15. White, D., Rotolo, M., Olsen, C., Prickett, J. Pig behavior and the contribution of individual pigs to pen-based oral fluids samples. In: 22nd IPVS Proceedings, Jeju, 2012.

16. Zanella, A. J. Método alternativo de coleta individual de fluido oral em suínos. Pirassununga: USP, 2015. (Comunicação oral).