UTILIZAÇÃO DE MALDI-TOF MS PARA IDENTIFICAÇÃO DE Streptococcus spp. DE SUÍNOS

 

O gênero Streptococcus é composto por bactérias de morfologia esférica que crescem em cadeias de comprimento variável. São cocos Gram-positivos, apresentam reação catalase negativa, são anaeróbios facultativos e imóveis. A espécie que apresenta maior importância para a industria suína é Streptococcus suis, (STAATS et al., 1997; GOYETTE-DESJARDINS et al., 2014). Os animais afetados são principalmente leitões entre 3 e 12 semanas de idade; estes animais apresentam quadros clínicos como meningite, pneumonia, artrite, endocardite, septicemia, abscessos e norte súbita (PERCH et al., 1983; GOTTSCHALK et al., 2007). Os métodos de identificação de laboratorio normalmente utilizados são: morfologia em ágar sangue, provas bioquímicas, identificação dos sorotipos e testes moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou sequenciamento parcial do gene 16S rRNA (PRIETO et al., 1994; STAATS et al., 1997; GOYETTE-DESJARDINS et al.,2014). Estes métodos muita vezes tem desvantagens como não especificidade de diferenciação entre as espécies por semelhanças morfológicas, maior tempo e custo no diagnóstico. Novas técnicas que foram adaptadas para o diagnostico microbiológico como a espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz em analisador por tempo de voo (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight) (MALDI-TOF MS), apresentam vantagens como: baixo custo e tempo na identificação dos agentes, além de conseguir diferenciar espécies de um mesmo gênero a parir do perfil proteico de cada agente (BIZZINI & GREUB, 2010). O objetivo do estudo é avaliar a utilização da técnica MALDI-TOF MS na identificação de diferentes espécies do gênero Streptococcus capazes de causar doença no suíno.

 

Foram analisadas 250 estirpes isoladas de suínos que apresentavam quadros clínicos de encefalite, artrite, pneumonia, metrite, infecção urinária ou septicemia, em diferentes estados brasileiros, entre os anos de 2001 a 2014. Estas estirpes mostraram características morfológicas sugestivas de Streptococcus s. As estirpes foram agrupadas de acordo com o sítio de isolamento - sistema respiratório, sistema nervoso central (SNC), sistema gênito-urinário, articulações, sangue, cavidade torácica, peritônio e coração - e reativadas a partir do estoque com 30% de glicerol mantido a -80°C. Cada cultura foi semeada em 4 ml de caldo BHI (brain heart infusion) enriquecido com 5% de soro fetal bovino e em ágar sangue de carneiro 5%, incubadas em aerobiose, durante 24 horas a 37°C. A partir deste cultivo foi separada uma alíquota para extração de proteína ribossomal; a alíquota foi centrifugada descartando o sobrenadante e mantendo o sedimento que foi suspenso em 300 μL de água ultrapura e adicionado 900 μL de etanol absoluto. A amostra foi centrifugada e o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi seco em temperatura ambiente. Foi adicionado 30 μL de ácido fórmico 70% e 30 μL de acetonitrila 100% de forma a homogeneizar o sedimento por completo e o microtubo foi centrifugado por 2 minutos a 13.000 rpm. Por fim, foram transferidos 50 μL desobrenadante ao microtubo novo que foi armazenado a -20°C. Para a leitura dos espectros, 1 μL de suspensão proteica foi transferido para a placa de aço inox de 96 poços e, após secar em temperatura ambiente, se adicionou 1 uL de matriz (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid). Cada cepa foi distribuída em três poços e para cada placa foram realizadas duas leituras. A partir dos espectros capturados, estes foram comparados com a biblioteca de espectros do fabricante pelo programa BioTyper 3.0 (Bruker Daltonik). Pela comparação de presença/ausência de picos específicos obtém-se um valor de escore (log (score) value); seguindo as recomendações do fabricante, os escores ≥ 2.0 foram aceitos para atribuição de espécie e escores ≥ 1.7 e < 2.0 foram utilizados para confirmação de gênero.

 

As estirpes foram agrupadas de acordo com os sítios de isolamento, sendo que 46,8% foram isoladas de SNC (117/250), 32,8% de sistema respiratório (82/250), 5,2% de sistema gênito urinário (13/250), 10% de articulação (25/250), 5,2% de outros sítios (13/250) (Tabela 1).

 

Tabela 1 – Frequência de estirpes avaliadas de acordo com o sitio de isolamento.

 

Todas as 250 estirpes foram avaliadas pelo MALDI–TOF MS, sendo que 86% (215/250) foram identificadas como Streptococcus suis com escore > 2.00 e (35/250) 14% foram identificadas como diferentes espécies do gênero Streptococcus. As espécies identificadas foram: S. hyovaginalis, S. oralis, S. hyointestinalis, S. sanguinis, S. henryi, S. alactolyticus, S. plurianimalium, S. dysgalactiae, S.gallinaceus, S. gordonii, S. gallolyticus e S. mitis (Tabela 2).

 

Tabela 2 – Distribuição das diferentes espécies de Streptococcus identificadas pelo MALDI-TOF MS de acordo com o sitio de isolamento.

 

Os resultados encontrados demonstram que a técnica MALDI-TOF MS, além de ser mais rápida que as demais técnicas, identifica outras espécies do gênero Streptococcus além de S. suis que podem também causar doença no suíno e que muitas vezes não são consideradas no momento do diagnóstico.

 

1. BIZZINI, A.; GREUB, G., 2010. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification. Clinical Microbiology and Infection, (16):1614–1619.

2. GOTTSCHALK, M.; SEGURA, M.; XU, J., 2007. Streptococcus suis infections in humans: the Chinese experience and the situation in North America. Animal Health Research Reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases, (8): 29–45.

3. GOYETTE-DESJARDINS, G.; AUGER, J.-P.; XU, J.; SEGURA, M.; GOTTSCHALK, M., 2014. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent—an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections, (3):45 

4. PERCH, B.; PEDERSEN, K. B.; HENRICHSEN, J., 1983. Serology of capsulated streptococci pathogenic for pigs: Six new serotypes of Streptococcus suis. Journal of Clinical Microbiology,(17): 993–996.

5. PRIETO, C.; GARCÍA, F.J.; SUÁREZ, P.; IMÁZ, M.; CASTRO, J.M., 1994. Biochemical traits and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughtered pigs. Zentralbl Veterinarmed B. Journal of Veterinary Medicine. Series B, (41): 608- 617.

6. STAATS, J. J.; FEDER, I.; OKWUMABUA, O.; CHENGAPPA, M. M., 1997. Streptococcus suis: Past and present. Veterinary Research Communications,(21):381–407.