IDENTIFICAÇÃO DE Aerococcus Viridans COMO AGENTE ETIOLÓGICO DE INFECÇÃO URINÁRIA EM MATRIZES

 

O gênero Aerococcus é composto por cocos Gram-positivos, catalase negativa, e podem ser observados individualmente, em pares ou mesmo grupos pequenos. São bactérias anaeróbias facultativas, cujas colônias em ágar sangue são circulares de 1 mm de diâmetro (MARTIN et al ., 2007). As colônias de Aerococcus sp. são fenotipicamente similares às colônias de Streptococcus e Staphylococcus. Esta bactéria já é considerada um patógeno do trato urinário no homem (GOPALACHAR et al., 2004). Na medicina veterinária e na indústria suína, este patógeno não faz parte do diagnóstico de rotina laboratorial; além disso, a semelhança morfológica das colônias em ágar sangue pode originar confusão com outras bactérias mais comumente diagnosticadas no suíno (RASMUSSEN, 2012). Dessa forma, as técnicas para rápido diagnóstico com alta especificidade para a identificação de microrganismos como a espectrometria de massa por MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight) ganham espação crescente na microbiología veterinária.

 

O diagnóstico por MALDI-TOF MS, além de ser rápido e de baixo custo, possibilita a identificação de bactérias que muitas vezes não estão incluídas na rotina laboratorial, mas que também podem causar doença no animal (SENNEBY et al., 2013). O objetivo do estudo foi avaliar a utilização da técnica MALDI-TOF MS para a identificação de Aerococcus viridans como agente etiológico de infecção urinária em matrizes.

 

Foram analisadas 22 estirpes isoladas de amostras de urina de 22 matrizes de três granjas no Estado de São Paulo/Brasil (Tabela 1). As amostras de urina foram triadas como sugestivas de infecção pela detecção de nitrito e esterase leucocitária e avaliação do pH pelo teste com tira reativa para urina. Foram centrifugados 10 ml de urina a uma velocidade de 4.000 g por 10 minutos; o pellet foi estriado em ágar sangue de carneiro (5%) e incubado em aerobiose durante 24horas a 37°C. As colônias isoladas foram repicadas em caldo BHI (brain heart infusion) enriquecido com 5% de soro fetal bovino. A partir deste cultivo foi separada uma alíquota para extração de proteína ribossomal utilizando o protocolo descrito por HIJAZIN et al. (2012). Para a captura dos espectros proteicos, 1 μL de suspensão proteica foi transferido para a placa de aço inox de 96 poços e, após secar em temperatura ambiente, se adicionou 1 uL de matriz polimérica (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid). Cada estirpe foi distribuída em três poços e para cada placa foram realizadas duas leituras. A partir dos espectros capturados, estes foram comparados com a biblioteca de espectros do fabricante pelo programa BioTyper 3.0 (Bruker Daltonik). Pela comparação de presença/ausência de picos específicos obtém-se um valor de escore (log (score) value); seguindo as recomendações do fabricante, os escores ≥ 2.0 foram aceitos para atribuição de espécie e escores ≥ 1.7 e < 2.0 foram utilizados para confirmação de gênero. Para a confirmação da identificação do MALDI-TOF MS foi realizada a amplificação parcial do gene 16S rRNA com os iniciadores descritos por TWOMEY et al. (2012). Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit Illustra GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare), seguindo as recomendações do fabricante, e sequenciados no Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco (IB-USP). As sequencias obtidas foram comparadas com o banco de dados nucléicos do NCBI (GenBank) pelo algorítimo BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool).

 

Todas as 22 estirpes foram avaliadas pelo MALDI –TOF MS e identificadas como Aerococcus viridans com escore > 2.00. A confirmação da identificação pelo sequenciamento parcial do 16S rRNA foi realizada para as estirpes U45, U62 e U83; as sequencias apresentaram alta identidade com Aerococcus viridans (> 99% de identidade das sequências) e, desta maneira, uma concordância completa com a identificação do MALDI –TOF MS. Pela semelhança morfológica das colônias, estas estirpes seriam identificadas na rotina laboratorial como sugestivas de Streptococcus e, em geral, a identificação de espécie não é continuada. Dessa forma, a real prevalência de Aerococcus viridans em infecções animais é subestimada, apesar de já ser reconhecido como um patógeno de crescente importância na medicina humana (RASMUSSEN, 2012). Até hoje, há apenas um estudo caracterizando Aerococcus viridans como patógeno oportunista em suínos, sendo este isolado de amostras de artrite, pneumonia e meningite (MARTIN et al, 2007). A bactéria ainda não havia sido relacionada como agente etiológico de infecção urinária em porcas. Mais estudos são necessários para confirmar se a bactéria é realmente mais frequente em fêmeas na fase de gestação e quais os fatores que estão associados à infecção.

 

Tabela 1 – Informação de origem e identificação das estirpes isoladas de infeção urinária.

* Amostras submetidas ao sequenciamento parcial do gene 16S rRNA para confirmação da identificação.

 

Os resultados encontrados neste estudo permitem concluir que Aerococcus viridans pode causar doença em suíno, apesar de ser uma bactéria que não é identificada na rotina de diagnóstico laboratorial. O MALDI-TOF MS se mostrou uma ferramenta válida para a diferenciação de microrganismos fenotipicamente muito semelhantes cujos resultados apresentam concordancia com o sequenciamento do gene 16S rRNA, de forma a possibilitar e facilitar o diagnóstico microbiológico veterinário.

 

1. GOPALACHAR, A.; AKINS, R. L.; DAVIS, W. D.; SIDDIQUI, A. A.; 2004. Urinary tract infection caused by Aerococcus viridans, a case report. Medical Science Monitor, (10):73-75.

2. HIJAZIN, M.; ALBER, J.; LÄMMLER, C.; WEITZEL, T.; HASSAN, AA.; TIMKE, M.; KOSTRZEWA, M.; PRENGER-BERNINGHOFF, E.; ZSCHÖCK, M.; 2012. Identification of Trueperella (Arcanobacterium) bernardiae by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry analysis and by species-specific PCR. Journal of Medical Microbiology.(61):457- 459.

3. MARTIN, V.; VELA, A. I.; GILBERT, M.; CEBOLLA, J.; GOYACHE, J.; DOMINGUEZ, L.; FERNANDEZ-GARAYZABAL J. F.;2007. Characterization of Aerococcus viridans Isolates from Swine Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, (45): 3053–3057.

4. RASMUSSEN, M.; 2013. Aerococci and aerococcal infections. Journal of Infection (66): 467-474.

5. SENNEBY, E.; NILSON, B.; PETERSSON, A.; RASMUSSENB, M.; 2013. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry Is a Sensitive and Specific Method for Identification of Aerococci. Journal of Clinical Microbiology, (51): 1303–1304.

6. TWOMEY, D.F.; CARSON, T.; FOSTER, G.; KOYLASS, M.S.; WHATMORE A.M.; 2012. Phenotypic characterisation and 16S rRNA sequence analysis of veterinary isolates of Streptococcus Veterinary pluranimalium. The Journal Volume, (192): 236–238.