Introdução
Com a intensificação da produção de suínos, os problemas sanitários têm sido uma preocupação constante para os técnicos e produtores, principalmente, referentes às enfermidades respiratórias, entre elas a Doença de Glässer (DG). A doença foi descrita pela primeira vez por K. Glässer (1910) na Alemanha, citado por Nielsen e Danielsen (1975). Após vários estudos, Biberstein e White isolaram e identificaram o Haemophilus parasuis (H. parasuis) em 1969.
H. parasuis é um microrganismo que pode ser encontrado na cavidade nasal de suínos saudáveis e também é o agente etiológico da DG que se caracteriza por poliserosite fibrinosa, poliartrite e meningite em suínos (Little, 1970). A ocorrência e a severidade da doença podem estar relacionadas ao estado imunitário dos animais. Em rebanhos com imunidade específica ou previamente exposto ao agente, a doença acomete suínos de 4 a 8 semanas (Nielsen e Danielsen 1975; Macedo et al., 2009). O diagnóstico conclusivo é baseado no histórico clínico do rebanho ao isolamento do agente, presente nas lesões características, e a sorotipagem (Rapp-Gabrielson et al. 1992; Aragon et al., 2012).
O impacto econômico da DG na produção de suínos, reflete na redução dos índices zootécnicos e aumento dos custos atribuídos ao seu controle e das co-infecções de origem viral e ou bacteriana (Liu et al., 2017). Sendo assim, esta revisão tem como objetivo fazer uma abordagem geral da DG e discutir os aspectos epidemiológicos, diagnóstico, imunidade e controle.
Etiologia
H. parasuis é uma bactéria gram negativa, imóvel, nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) dependente e membro da família Pasteurallaceae. No entanto, a classificação do gene 16S RNAr mostrou que o Haemophilus, o Actinobacillus e a Pasteurella, não formam um grupo monofilético dentro da Pasteurallaceae (Angen et al., 2007).
As cepas de H. parasuis são distintas em aspectos fenotípicos, genotípicos e virulência, sendo essencial a classificação para o diagnóstico e controle do H. parasuis. Aragon et al., 2012 descreveram que a diferenciação das cepas do H. parasuis em patogênicas e não patogênicas é imprescindível quando se visa estratégias vacinais no rebanho. Os primeiros estudos para classificação foram baseados nas propriedades antigênicas definidas pelo teste de imunodifusão em gel de Agar (AGID) usando antígenos solúveis termoestáveis e anticorpos policlonais de coelho (Morozumi e Nicolet, 1986; Rapp-Gabrielson e Gabrielson, 1992). Os isolados que compartilharam antígenos similares foram classificados em 15 sorovares (Kielstein e RappGabrielson, 1992).
A alta porcentagem de cepas isoladas não tipificáveis (NT), identificadas através da AGID, levaram ao desenvolvimento de um método de sorotipificação através da hemaglutinação indireta, o qual é mais eficiente na classificação do H. parasuis dentro dos 15 grupos de sorovares já reconhecidos (Del Río et al., 2003a; Tadjine et al., 2004). Entretanto, com essa técnica, a redução no número de isolados NT não foi satisfatória e ocorreram várias discrepâncias. Esses resultados contraditórios foram, provavelmente, devido aos diferentes métodos de diagnósticos, tipos de anticorpos e reações inespecíficas. O alto percentual de cepas NT entre os 15 sorogrupos conhecidos sinaliza para a existência de outros sorogrupos ainda não identificados (Turni e Blackall, 2005).
Os sorovares 4, 5 e NT são os mais prevalentes na maioria dos países (RappGabrielson e Gabrielson, 1992; Del Río et al., 2003b; Oliveira et al., 2003; Tadjine et al., 2004; Cai et al., 2005; Turni e Blackall, 2005; Lin et al., 2018; Zhao et al., 2018). Os estudos de Castilla et al. (2012) realizados em vários Estados Brasileiros mostraram alta prevalência para os sorovares 2, 4, 5, 13, 14 e NT.
Na literaturra não há registros de correlação entre sorovares e virulência. No entanto, os sorovares 7, reconhecido como não virulento, foi inoculado em suínos utilizando a metodologia descrita por Aragon et al. (2012) e os sinais clínicos característicos da DG foram evidenciados. Métodos de genotipagem têm sido utilizados para classificar as cepas de H. parasuis. A vantagem da genotipagem em relação à sorotipagem é a possibilidade de classificação de todas as cepas.
Com aplicação das técnicas como DNA fingerprint e sequenciamento genético, foi confirmada a alta heterogeneidade do microrganismo (Yue et al., 2009). O H. parasuis foi sequenciado pela primeira vez utilizando enzimas de restrição que fazem a digestão do DNA genômico fragmentando o mesmo em sítios de restrição específicos, facilitando a análise dos fragmentos (Smart et al., 1989). Esse método de análise permitiu a caracterização de diferentes cepas da bactéria em animais de uma mesma granja. Os mesmos autores descreveram que as cepas diferentes podem ser identificadas em um único animal, ocasionando localizada ou doença sistêmica. Essas informações foram posteriormente confirmadas por técnica molecular, usando primers para sequências repetitivas intergênicas de enterobactérias (ERIC-PCR) (Rafiee et al., 2000; Ruiz et al., 2001).
Não há uma relação direta entre genótipo e sorovares. As bactérias de uma mesma cepa podem ser de sorovares diferentes, assim como cepas de H. parasuis diferentes podem ser de um mesmo sorovar (Oliveira et al., 2003; Turni et al., 2010). Essas diferenças podem estar relacionadas com diferentes expressões in vitro dos antígenos solúveis termoestáveis ou, provavelmente, o baixo índice de reprodutibilidade das técnicas de sorotipagem. A baixa associação entre genótipo e sorovar também foi confirmada por três diferentes protocolos de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP-PCR) usando tbpA (De La Puente Redondo et al., 2003), 16s rRNA (Olvera et al., 2012) e aro A genes (Del Río et al., 2006).
Yue et al. (2009) demonstraram o sequenciamento de uma cepa chinesa de H. parasuis SH0165 (número de acesso GeneBank CP001321), sorovar 5 virulento. O genoma possuía um tamanho de 2.3 Mb constituído por mais de 2000 genes identificados. Supostos genes associados à virulência foram detectados na cepa SHSH0165, entretanto, pouco se conhece sobre a função desses genes na patogenia da DG.
ência é importante para diferenciar as cepas patogênicas e para desenvolvimento de vacinas eficazes. Segundo Li et al. (2016) três métodos de identificação têm sido utilizados: análise das diferenças genéticas das cepas virulentas e não virulentas, a expressão gênica dos genes de virulência das cepas in vivo e a criação de cepas geneticamente modificadas. O gene d presente no H. parasuis, que confere resistência às sulfonamidas, tem sido encontrado no sorovar 2, enquanto é ausente nos sorovares 1, 3 e 5 (Del Río et al., 2005). Entretanto, a relação desse gene com a virulência não é esclarecida. Acredita-se que possa ser específica de uma cepa e o gene d H. parasuis possa ser transferido por plasmídeos.
Os autores Sack e Baltes (2009) realizaram uma comparação com uma cepa Nagasaki virulenta do H. parasuis sorovar 5 com uma cepa não virulenta de sorovar 11. Os autores detectaram vários genes específicos do sorovar 5, responsáveis pela hemolisina (hhdAB), pela aquisição de ferro (cirA) e genes relacionados ao fago. Mesmo esses genes ausentes nas cepas não virulentas, eles não são comuns nas cepas virulentas, mostrando que eles não são indicativos da virulência do H. parasuis. Zhou et al. (2010), em estudos similares, identificaram 15 genes que estavam presentes apenas na cepa Nagasaki virulenta e ausente na cepa não virulenta SW114 de sorovar 3. Porém, removendo o gene relacionado ao desenvolvimento das fímbrias (fimB) que poderia exercer um papel importante na colonização da bactéria, os demais genes apresentaram relação com o metabolismo bacteriano.
Com o intuito de identificar os fatores de virulência do H. parasuis, os autores Metcalf e Mcinnes (2007) estudaram a expressão gênica simulando o ambiente de uma infecção in vivo, por exemplo, altas temperaturas, meio ácido, restrição de ferro e/ou incubação em fluido cerebroespinhal. Os estudos de Jin et al. (2008) mostraram que os genes homólogos vtaA (responsável pela produção de adesina) e sai B (responsável pela utilização de ácido siálico) são relacionados, provavelmente, a virulência da bactéria. Esses genes foram expressos in vivo nos pulmões infectados dos suínos inoculados com a cepa 0165 de H. parasuis. Cao et al. (2018) mostraram que o complexo de sinalização da transdução CpxA possui relação direta na tolerância ao estresse alcalino, oxidativo e osmótico, com a utilização de cepas do sorovar 4 mutantes, ao qual os receptores de histidina CpxA foram desligados com a utilização de um plasmídio recombinante. Zhao et al. (2016) identificaram os genes o vca J responsáveis pela formação de biofilme que desempenham papel importante na colonização e infecção causada pela bactéria.
H. parasuis é um microrganismo normal da microbiota respiratória dos suínos, que coloniza o trato respiratório dos leitões, logo ao nascimento. Os estudos de Angen et al. (2007) e Cerdà-Cuéllar et al. (2010) mostraram que o H. parasuis foi identificado em swabs nasais de suínos até 6 meses, com a prevalência máxima de sua colonização atingida aos 60 dias de idade. Segundo Rafiee et al. (2000), apesar da grande variedade de cepas identificadas, normalmente, os surtos estão associados a uma única cepa mais prevalente no rebanho.
Num cenário saudável, os suínos devem desenvolver equilíbrio entre a colonização do agente e a imunidade específica para não desenvolver a doença. Entretanto, quando há uma alteração nesse equilíbrio, o H. parasuis tende a se multiplicar e causar a doença. Diferentes fatores podem desencadear esse desequilíbrio como temperatura ambiente instável, ventilação inadequada no galpão, desmame precoce, imunidade específica insuficiente do animal, presença de outros patógenos ou presença de uma cepa virulenta de H. parasuis (Aragon et al., 2012).
Os suídeos doméstico (Sus scrofa domesticus) e selvagem (Sus scrofa scrofa) são reconhecidos como os únicos hospedeiros de H. parasuis. A bactéria tem sido isolada de suídeos selvagens e anticorpos foram titulados nestes animais, porém a DG não foi relatada. O papel epidemiológico dos suídeos selvagens como reservatórios para infecções por H. parasuis precisa ser melhor estudado (Vengust et al., 2006).
A transmissão da doença de Glässer ocorre pelo contato dos animais portadores ou doentes com animais susceptíveis. No entanto, mistura de animais de diferentes origens, como ocorre no Brasil, principalmente, no desmame ou final de creche, é um dos fatores de risco mais importante para disseminação da enfermidade. H. parasuis mostra-se bastante instável às condições ambientais, não havendo muitos estudos que comprovem resistência das bactérias a desinfetantes como hipoclorito e quaternário de amônia (Rodríguez-Ferri et al., 2010).
Patogênese
A patogenia da DG ainda não está totalmente esclarecida. Segundo Bouchet et al. (2009) as etapas de colonização bacteriana no trato respiratório são adesão das bactérias as células epiteliais do sistema respiratório superior, indução de apoptose celular e liberação de citoquininas. Após a colonização nasal, a bactéria atinge os pulmões e outros órgãos internos, depois de uma breve passagem pelo sangue (Frandoloso et al., 2013). A infecção sistêmica inicia-se nos pulmões e as bactérias espalham-se pelo corpo através das vias aéreas inferiores alcançando os demais órgãos (Bello-Orti et al., 2014). Nos alvéolos pulmonares as cepas virulentas de H. parasuis não são destruídas pelos macrófagos alveolares dos suínos (PAMs). Devido a presença da cápsula as cepas atingem a via sistêmica (Rapp-Gabrielson et al., 1992; Costa-Hurtado e Aragon, 2013), enquanto as cepas não virulentas são facilmente fagocitadas pelos PAMs (Olvera et al., 2009). Na sequência, o H. parasuis invade as células endoteliais provocando apoptose e produção de isoleucinas proinflamatórias IL-6 e IL-8. Esses fenômenos aparentam ter um papel importante na passagem do agente para o sangue e através da barreira hematocefálica (Aragon et al., 2012). Visivelmente, os lipoligosacarídeos (LOS) têm um papel parcial na adesão às células endoteliais e na resposta inflamatória (Bouchet et al., 2009). Finalmente, quando H. parasuis atinge os órgãos internos ele se multiplica na superfície das serosas, causando lesão vascular com consequente deposição de fibrina e extravasamento de fluidos nas cavidades, característico da DG.
A sobrevivência da bactéria durante a infecção depende da aquisição de nutrientes e, no hospedeiro, alguns nutrientes são escassos como no caso do ferro livre. Entretanto, H. parasuis pode adquirir ferro através de receptores de superfície como TbpA e FhuA (Del Río et al., 2006). Além disso, a bactéria possui em sua superfície uma neuroaminidase que atua como captadora de ácido siálico responsável pelo mecanismo de evasão ao sistema imune do hospedeiro (Lichtensteiger e Vimr, 1997).
H. parasuis pode atuar como patógeno primário ou secundário a outras infecções quando o organismo do animal fica imunossuprimido. Nestes casos, a bactéria que normalmente é restrita ao trato respiratório, atinge outros órgãos causando infecção sistêmica (Olvera et al., 2009). Associações epidemiológicas com agentes virais têm sido descritas na literatura, por exemplo, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória (PRRSV), Circovirus suíno 2 (PCV2) e o Vírus da influenza tipo A (Kim et al., 2002; Li et al., 2009; Van Reeth et al., 2012; 2015; Morés et al., 2015; Liu et al., 2017). De acordo com Kavanová et al. (2018) o vírus da PRRS inibe a expressão de citocinas próinflamatórias nos macrófagos acumulados nas regiões de inflamação, o que pode favorecer ao crescimento de bactérias secundárias como o H. parasuis.
Sinais clínicos e lesões
Os sinais clínicos são observados, principalmente, em suínos de 4 a 8 semanas, apesar de em alguns casos afetar animais adultos, depende da imunidade adquirida na maternidade e do nível da colonização bacteriana (Oliveira, 2007). Aragon et al. (2012) evidenciaram que leitões livres de H. parasuis e infectados pelo patógeno, o período de incubação varia de 24h até 5 dias de acordo com a cepa infectante.
A fase superaguda da doença tem uma evolução rápida (<48h) e pode resultar em morte súbita sem demonstrar lesões características no animal (Peet et al., 1983). Na fase aguda os sinais são perceptíveis, caracterizados por febre alta (41,5ºC), apatia, tosse discreta, respiração abdominal, artrite e claudicação. Quando a bactéria atinge o cérebro observam-se sinais nervosos como decúbito lateral, incoordenação motora, movimentos de pedalagem e tremores (Vahle et al., 1995). Esses sinais podem ser vistos individualmente ou coletivamente. Animais com sinais clínicos leves a moderados, normalmente, sobrevivem à fase aguda da doença e desenvolvem a fase crônica caracterizada por pelagem áspera, redução da taxa de crescimento, e eventualmente dispnéia e tosse (Little, 1970; Narita et al., 1994).
Morbidade e mortalidade dos animais afetados por DG têm sido variável. As taxas de morbidade e mortalidade em rebanhos convencionais variam de 5-10% e em rebanhos livres do H. parasuis (naïves) podem chegar a 75% (Aragon et al., 2012). A prevalência da doença é afetada por situações de estresse ao animal e infecções virais concomitantes que afetem o sistema imune como Circovirus suíno tipo 2 (PCV2) (Kim et al., 2002).
Em casos de morte súbita até 48h, não há lesões características, mas o suíno pode apresentar hemorragia petequiais em diversos órgãos parenquimatosos e fluido serosanguinolento, ausência de fibrina, nas cavidades torácica e abdominal. Esses animais apresentam lesões microscópicas características de septicemia como micro hemorragias e coagulação intravascular disseminada (trombos de fibrina em diferentes tecidos como glomérulo renal, sinusoide do fígado e capilares pulmonares) (Peet et al., 1983; Valhe et al., 1997).
A doença sistêmica aguda é caracterizada pelo desenvolvimento de poliserosite fibrinosa ou fibrinopurulenta. O exsudato fibrinoso pode ser observado nas pleuras, pericárdio, peritônio (Figura 1A), líquido sinovial (Figura 1B) e meninges. Normalmente é acompanhado pela grande quantidade de fluido que se acumula nas cavidades pleural, pericárdica, peritoneal e articulares (Oliveira et al., 2003). No mesmo animal apenas uma ou várias combinações de serosas podem estar afetadas. A pleurite fibrinosa (Figura 1C) pode ou não ser encontrada concomitante com consolidação cranioventral no pulmão devido à broncopneumonia catarral, ou raramente, broncopneumonia fibrinohemorrágica (Little, 1970; Narita et al., 1994). A meningite fibrinosa (Figura 1D) é encontrada em 80% dos casos dos animais com sintomatologia nervosa (Aragon et al., 2012). Os suínos afetados pela fase crônica da doença têm grave fibrose no pericárdio, pleura e peritônio, provocando aderências firmes dessas serosas (Figura 1E e 1F), bem como poliartrite crônica.
Microscopicamente, os animais na fase aguda apresentam infiltrados inflamatórios acentuados nas serosas e tecidos subjacentes, compostos predominantemente por neutrófilos com moderada presença de mononucleados. Há ainda, presença moderada-acentuada de exsudato fibrinoso nas serosas afetadas, principalmente membrana sinovial, pleura, meninge e pericárdio (Peet et al., 1983; Valhe et al., 1995).
Diagnóstico
H. parasuis requer o fator V (nicotinamida adenina dinucleotídeo-NAD) para crescimento. Segundo Aragon et al., (2012), o meio ideal de cultivo para o crescimento bacteriano é o ágar chocolate enriquecido. O meio Agar sangue comum (sangue desfibrinado de carneiro) possui o fator V para o crescimento da bactéria, no entanto, o mesmo não está disponível, pois se encontra no interior das hemácias. Sendo assim, utiliza-se o Staphylococcus spp. no cultivo, fazendo uma estria transversal na região onde foi realizada a semeadura do H. parasuis. O Staphylococcus spp. será a fonte do fator V, necessário para as cepas H. parasuis, já no meio ágar chocolate as hemácias estão rompidas facilitando o acesso ao NAD. As cepas H. parasuis requerem 1-3 dias para aparecer em pequenas colônias marrom-acinzentadas no meio ágar chocolate, ou, pequenas colônias translúcidas não-hemolíticas no meio ágar sangue, adjacente as estrias feitas com Staphylococcus spp. (Biberstein e White 1969; Oliveira, 2007).
H. parasuis pode ser isolado do exsudato fibrinoso e do parênquima dos órgãos afetados, como dos pulmões lesionados em casos de pneumonia. As possibilidades de isolamento do H. parasuis aumentam consideravelmente se a coleta for feita com swabs do líquido serofibrinoso ou do exsudato colhido das cavidades (torácica e abdominal) utilizando seringa. A amostra biológica selecionada para isolamento do H. parasuis deve ser mantido em refrigeração e as análises laboratoriais realizadas até 24 horas. Para obter êxito no isolamento bacteriano recomenda-se que as amostras sejam colhidas de animais na fase aguda da doença e que não tenham sido medicados com antimicrobianos. Mesmo sendo um microrganismo fastidioso o isolamento, a tipificação das cepas e antibiograma devem ser realizados (Turni et al. 2010).
O agente pode ser também identificado nos tecidos hepáticos, pericárdio, pulmão e meninge utilizando as técnicas de imunohistoquímica (IHQ) ou a hibridização in situ (IHS). Entretanto, a especificidade da IHS não foi totalmente esclarecida e alguns testes de IHQ apresentaram reação cruzada com Actinobacillus pleuropneumoniae (Segalés et al., 1997; Jung et al., 2004).
As técnicas moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional e quantitativa (PCRq) permitem isolar e caracterizar cepas virulentas e não virulentas do H. parasuis, mesmo quando o microrganismo não está mais viável no hospedeiro (Oliveira et al., 2001; Angen et al., 2007; Turni et al., 2010; Olvera et al., 2012; Jia et al., 2017). Olvera et al. (2012) desenvolveram um teste de PCR multiplex baseado na detecção do gene vtaAs e pode ser utilizado para caracterizar isolados da bactéria independente do seu potencial invasivo. A informação é relevante, principalmente, quando se seleciona isolados para realização de antibiogramas ou para produção de vacinas autógenas. Jia et al. (2017), na China desenvolveram uma PCR capaz de detectar os sorovares cepas do H. parasuis, mostrando resultados semelhantes ao teste tradicional de hemaglutinação indireta. Todavia, como existem cepas classificadas como não virulentas capazes de causar a doença, é sempre importante utilizar testes moleculares a partir de isolados de material patológico de sítios não respiratórios como das cavidades pleural, pericárdica, abdominal, sinovial ou das meninges (Oliveira, 2007; Turni et al, 2010; Aragon et al., 2012).
A PCRq descrita por Turni e Blackall et al. 2007 demonstraram um limite de detecção de 0.83- 9.5 unidades formadoras de colônia (UFC) por reação, mostrando-se mais sensível do que a PCR convencional. Os mesmos autores sinalizaram que a PCR convencional precisa ser interpretado com cautela, pois não necessariamente um animal positivo significa que o mesmo possui a doença e deve ser sempre interpretado junto com o quadro patológico.
Anticorpos contra H. parasuis podem ser detectados utilizando os testes de fixação do complemento (FC) ou imunoenzimático (ELISA). A FC tem sido utilizada para detecção da resposta imune em infecções experimentais (Nielsen, 1993), assim como o teste de ELISA tem sido mais utilizado em pesquisas. O ELISA indireto tem sido utilizado para caracterizar a transmissão de anticorpos maternais e demonstrar a soroconversão após a vacinação (Cerdà-Cuéllar et al., 2010). Blanco et al. (2004) utilizaram kits convencionais de ELISA para avaliar o perfil de anticorpos maternais nos leitões com o intuito de identificar um período de susceptibilidade para infecção no sistema convencional de produção. O problema, entretanto, está na especificidade dos kits convencionais utilizados, pois não se tem comprovações de que o anticorpo identificado é realmente para H. parasuis, além de ter problemas para diferenciar os sorovares. Essas são as razões porque os testes sorológicos são utilizados mais nas pesquisas e nos estudos de dinâmica da infecção para avaliação de programas vacinais e terapêuticos (Cerdà-Cuéllar et al., 2010). Os sinais clínicos, as lesões macroscópicas e microscópicas descritas nas infecções sistêmicas por H. parasuis não são patognomônicos, sendo assim, outros microrganismos precisam ser considerados no diagnóstico diferencial. Poliserosite fibrinosa pode ser causada por outras bactérias gram-negativas como Escherichia coli não hemolítica afetando normalmente leitões na maternidade (Aragon et al., 2012). A toxina Shiga 2 e beta-hemolítica (Stx2e) produzida pela E. coli na doença do edema pode causar sinais nervosos em leitões recémdesmamados similares aos sinais nervosos causados pela infecção sistêmica por H. parasuis. Entretanto, microscopicamente, Stx2e não causa meningite fibrinopurulenta como as infecções por H. parasuis. Por outro lado, causa necrose das células musculares lisas das artérias e arteríolas (Moxley, 2000). Mycoplasma hyorhinis é outro importante agente que pode causar poliserosite fibrinosa em leitões na maternidade, sendo encontrado nas coinfecções com H. parasuis (Thacker e Minion, 2012). Quando a Glässer cursa com quadro nervoso de meningite fibrinosa, a principal doença a ser afastada é a meningite causada por Streptococcus suis, pois afeta suínos da mesma idade que o H. parasuis e pode causar sintomas e lesões similares (Aragon et al., 2012). Pasteurella multocida também pode causar pleurite/ pericardite com aderências na fase crônica devido à reação inflamatória severa. Porém, essa enfermidade afeta predominantemente suínos na fase de terminação e assim como na infecção por Actinobacillus pleuropneumoniae, podem causar nódulos necrohemorrágicos localizados nos pulmões (Oliveira Filho et al., 2015). Outros agentes podem causar claudicação e artrite assim como H. parasuis, por exemplo, Erysipelothrix rhusiopathiae e Mycoplasma hyosynoviae. Porém esses agentes provocam artrites crônicas, não purulentas, em animais de terminação, diferentemente de H. parasuis que afeta normalmente animais jovens (Aragon et al., 2012).
Considerando que H. parasuis é natural da microbiota do trato respiratório superior de suínos saudáveis, a detecção na cavidade nasal ou na traqueia não é indicativo de uma infecção. Cepas de H. parasuis isolados de casos sistêmicos das serosas/cavidades ou de órgãos parenquimatosos associados aos sinais e lesões é confirmativo que o animal está sendo acometido pela DG (Aragon et al., 2012).
Imunidade
H. parasuis, como qualquer outra bactéria gram-negativa, mobiliza a resposta inata e a resposta específica do sistema imune em níveis variados. A literatura mostra distintas respostas imunes mediadas por anticorpos, mas poucas informações têm sido descritas sobre resposta mediada por células (Aragon et al., 2012). A aplicação de técnicas de Imunohistoquímica (IHQ) e hibridizações in situ (IHS) realizadas durante o curso da infecção demonstraram que o H. parasuis é fagocitado por neutrófilos e macrófagos, podendo ser encontrado degenerado no interior dos fagossomos (Segalés et al.,1997). Cepas não virulentas são prontamente fagocitadas pelos PAMs, enquanto as cepas virulentas necessitam que haja opsonização pelos anticorpos específicos. Uma vez que o processo de endocitose ocorra e a bactéria seja fagocitada pelos PAMs, ela será destruída independente da virulência (Olvera et al., 2009). H. parasuis estimula a produção de IL-6 (em menor quantidade) e IL-8, citocinas próinflamatórias que são produzidas pelas células traqueais dos suínos e pelas células microvasculares endoteliais do cérebro após adesão da bactéria. A IL-8 é um potente mediador químico que atrai leucócitos, enquanto a IL-6 é um importante mediador para resposta imune aguda (Bouchet et al., 2009).
A resposta de anticorpos após a exposição de suínos ao H. parasuis tem sido descrita em animais vacinados, com colonização sistêmica pela bactéria e em animais convalescentes através dos testes de fixação de complemento (FC), Western blot e imunoenzimático (ELISA) (Nielsen, 1993; SolanoAguilar et al., 1999). Os suínos expostos a culturas vivas de H. parasuis ou vacinados com bacterinas inativadas produziram de forma transitória imunoglobulina M (IgM) seguido por uma produção sólida e progressiva de imunoglobulina G (IgG). Suínos que já foram expostos ao H. parasuis produziram anticorpos contra o vtaAs, porém as respostas às vacinas inativadas não produziram uma quantidade ideal de anticorpos (Olvera et al., 2010). Para o desenvolvimento de uma imunidade humoral contra H. parasuis, o animal normalmente precisa ser exposto a células vivas ou inativadas do agente, produzindo assim anticorpos específicos. Os anticorpos específicos opsonizam as bactérias facilitando a fagocitose pelos PAMs (Olvera et al., 2009).
Nas infecções experimentais foi observado que as vacinas homólogas garantem proteção total e as vacinas heterólogas apenas proteção parcial contra o agente, razão pela qual as vacinas, para induzir melhor proteção contra o H. parasuis, devem ser sorovar específicas (Nielsen, 1993; Takahashi et al., 2001). A exposição de células vivas de H. parasuis também gera uma imunidade protetora nos animais. Nielsen (1993) verificaram que a exposição dos animais a aerossóis com sorovares 2, 3, 4 e 7 da bactéria viva, houve resposta de anticorpos e resistiram a uma infecção induzida com cepa virulenta sorovar 5. RappGabrielson et al. (1997) descreveram que a definição da imunidade cruzada devido ao contato dos animais com os sorovares ou cepas diferentes é uma tarefa difícil.
A exposição controlada feita com culturas de cepa H. parasuis a leitões de cinco dias de idade demonstrou mortalidade menor no rebanho em comparação as vacinas comerciais homólogas e vacinas autógenas. As vacinas inativadas, normalmente, utilizam antígenos incompletos. Sendo assim, a produção de anticorpos não é eficiente, pois existem antígenos de virulência que somente são expressos na bactéria viva. A produção de vacinas inativadas contendo todos os sorovares não é viável, pela dificuldade em obter uma concentração adequada de antígeno para cada sorovar. (Oliveira e Pijoan, 2003). Atualmente, estão disponíveis no mercado vacinas contendo até três sorovares (Xue et al., 2014). Uma possível alternativa as vacinas inativadas são as ghost vaccines que têm propriedades imunogênicas similares com a bactéria original, mas não são infecciosas devido à ausência dos ácidos nucleicos. Essas vacinas ainda não estão disponíveis no mercado (Hu et al., 2013).
Os anticorpos maternais têm papel relevante na imunidade dos leitões contra o H. parasuis. Oliveira et al. (2003) e Blanco et al. (2004) observaram que leitões com baixa imunidade materna foram infectados com pequenas doses de inóculo de H. parasuis. Enquanto, leitões que receberam alto títulos de anticorpos maternais ficaram protegidos. Os estudos de Cerdà-Cuéllar et al. (2010) demonstraram a dinâmica da imunidade maternal utilizando leitões infectados pelo H. parasuis nascidos de matrizes vacinadas e não vacinadas. De acordo com esse estudo, os anticorpos dos leitões provenientes de matrizes não vacinadas chegavam ao nível mínimo a partir dos 20 dias de idade. No entanto, leitões provenientes das matrizes vacinadas a imunidade declinou a partir dos 60 dias de idade. O momento em que houve o declínio dos anticorpos ocorreu a colonização por H. parasuis no trato respiratório superior. Leitões provenientes de matrizes vacinadas tinham menor quantidade da bactéria e menor variedade de cepas no trato respiratório (Cerdà-Cuéllar et al., 2010).
Prevenção e controle
A vacinação e os antibióticos são os principais métodos utilizados no combate ao H. parasuis. Em alguns países, a regulamentação não permite o uso de antibióticos na profilaxia da doença, aceitando apenas o uso em casos de tratamento da infecção. Devido a essas regulamentações, a vacinação se tornou o principal meio de prevenir a infecção sistêmica e a mortalidade no rebanho (Aragon et al., 2012).
O tratamento individual via parenteral é recomendado nos suínos com sinais da doença, pois este se torna preciso e eficiente quando realizado no início do quadro clínico. O uso de medicamento na ração e na água não é indicado nesses casos porque os animais acometidos ficam prostrados, não consumindo a quantidade de ração ou água requerida para o tratamento. A susceptibilidade do H. parasuis a determinados antibióticos é diferente em cada região, mostrando assim a importância do antibiograma da cepa que está causando a doença no rebanho. No Reino Unido as cepas foram sensíveis à maioria dos antibióticos utilizados, enquanto na China e Espanha as cepas apresentaram resistência aos antibióticos comuns, como por exemplo, tetraciclina e beta-lactâmicos (Martín de La Fuente et al., 2007; Zhou et al., 2010). A Enrofloxacina, uma fluroquinolona com atividade contra bactérias gram-negativas e gram-positivas, é o antibiótico mais utilizado no combate a H. parasuis, apesar do mecanismo de ação não ser bem definido. Sabe-se que a droga auxilia na morte intrafagocitária da bactéria nos PAMs, diminuindo a colonização sistêmica (Macedo et al., 2014). A amoxicilina é outro fármaco muito utilizado no controle de H. parasuis, devido sua ampla atividade contra bactérias aeróbias gram-negativas (Karriker et al., 2012). Entretanto, Olvera et al. (2007) verificaram em uma fazenda experimental, que após um ano de tratamento com amoxicilina cerca de 40% das cepas de H. parasuis apresentaram resistência a este fármaco.
Um sistema de biosseguridade rígido e o controle de fatores de riscos que favorecem a infecção são importantes na prevenção da doença. A mistura de leitões de diferentes origens na creche ou recria bem como a introdução de animais positivos para cepas patogênicas nos rebanhos são os principais fatores associados à ocorrência de surtos da doença. Provocar uma colonização natural nos leitões no período de amamentação (imunidade materna alta) não é efetivo devido à alta variedade de cepas circulantes no ambiente e a dificuldade dos suínos na produção de anticorpos para cepas heterólogas (Oliveira e Pijoan, 2003). O estresse dos animais causado por variações de temperatura, superlotação nas baias, brigas por mistura de leitões e desmame precoce são fatores que necessitam ser amenizados, pois podem desencadear a infecção sistêmica pelo H. parasuis (Macedo et al., 2009). Além disso, a higiene das instalações, com fluxo unidirecional e com limpeza e desinfecção completa das salas/instalações seguido de adequado vazio sanitário entre lotes são práticas de manejo fundamentais para controle de qualquer doença na suinocultura moderna (Aragon et al., 2012).
As vacinas comerciais ou autógenas são ferramentas importantes na prevenção da doença. No entanto, precisam conter cepas virulentas e endêmicas da propriedade para haver uma maior efetividade (Martín de La Fuente et al., 2009; Huisheng et al., 2016). Nas vacinas autógenas devem estar presentes cepas isoladas de sítios sistêmicos dos animais afetados a partir do líquido serofibrinoso das serosas afetadas (Smart e Miniats, 1989). Evitar utilizar cepas de H. parasuis para produção da vacina a partir de swabs nasais, parênquima pulmonar ou tonsilas.
Considerações finais
A DG continua sendo um problema sanitário, especialmente, para a suinocultura moderna praticada em larga escala. Com as restrições cada vez mais acentuadas ao uso de antimicrobianos, é necessário avanço nas técnicas de diagnósticos, implementação de boas práticas de manejo e controle das co-infecções que potencializam a ocorrência da DG nos plantéis de suínos.
