Mycoplasma Pneumonia Enzoótica Suina

INTRODUÇÃO

A pneumonia enzoótica (PE) é uma doença crônica infecciosa, causada pelo Mycoplasma hyopneumoniae (6,7). Clinicamente manifesta-se por tosse seca e baixo ganho de peso. As lesões consistem em áreas de consolidação pulmonar de cor púrpura a cinza, principalmente nos lobos apicais, caracterizando uma broncopneumonia catarral (6). O diagnóstico presuntivo pode ser feito baseado nas manifestações clínicas e lesões macroscópicas e microscópicas (7). A confirmação é feita através de isolamento, entretanto sua aplicação é restrita devido às dificuldades de crescimento do agente. Outras provas diagnósticas podem ser utilizadas, como ELISA, PCR, hibridização in situ (HIS) e imunoistoquímica (IHQ) (7). Dentre estas, a IHQ é extremamente útil na confirmação do diagnóstico, pois combina técnicas morfológicas, imunológicas e bioquímicas. Além disto, pode ser realizada a partir de tecido parafinizado, o que facilita a armazenagem de material a campo. Entretanto, as diversas etapas desta técnica, desde o preparo da amostra até o resultado final, podem levar a falhas na interpretação do resultado. Dentre estas destacam-se: fixação do tecido, recuperação antigênica, bloqueio da peroxidase endógena, método de detecção, tipo de anticorpos, pH e temperatura das soluções e tipo de cromógeno (1,5). A alta freqüência e a extensão destas falhas exigem um correto uso de controles e de padronização das etapas da técnica, com grande foco para a recuperação antigênica (RA). A necessidade de uma correta padronização da RA faz-se necessária, pois a maioria das amostras é acondicionada em formaldeído, e este fixador pode levar a ligações não específicas do antígeno, bem como alteração na conformação das proteínas, dificultando à ligação com o anticorpo (1,3,5). Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar uma técnica de IHQ para M. hyopneumoniae, utilizando diferentes protocolos de recuperação antigênica, combinando altas temperaturas e enzimas proteolíticas, em pulmões de suínos fixados em formaldeído.


MATERIAL E MÉTODOS

Para otimização da técnica de IHQ, foram selecionadas 10 amostras de pulmão de suínos com lesões microscópicas sugestivas de PE. Cinco amostras eram de suínos infectados naturalmente (A, B, C, D e E) e cinco eram de suínos infectados experimentalmente (F, G, H, I e J), com M. hyopneumoniae. Os tecidos foram seccionados em 4 μm e colocados sobre lâminas de vidros revestidas com poly-L-lisina (Sigma® P- 8920). O mesmo procedeu-se com pulmão de suíno livre de patógenos específicos (SPF), que funcionou como controle negativo da técnica. Os cortes foram desparafinados em xilol e reidratados em soluções em álcool decrescentes. Foram testados cinco tratamentos diferentes de RA: tripsina (1), pepsina (2), microondas (3), microondas + pepsina (4) e microondas + tripsina (5). A tripsina (Sigma-Aldrich®) foi diluída a 0,1% em solução salina Tris-fosfato (TBS) pH 7.6, e a pepsina (Sigma-Aldrich®) diluída a 0,1% em 0,04% de ácido clorídrico 0,01N em água destilada; ambas foram incubadas por 10 minutos. A RA em microondas foi realizada em tampão citrato pH 6.0, 10mM, em forno microondas doméstico a 700w, dois ciclos de 10 minutos cada. Em seguida procedeu-se o bloqueio da peroxidase endógena com H₂O₂ 3% em TBS, durante 5 minutos. Foram testados dois anticorpos policlonais monoespecíficos contra proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae (2), um correspondente a proteína lactato-desidrogenase (p36) na diluição 1:200, e outro contra a subunidade R2 da ribonucleotide redutase (NrdF) na diluição 1:800, incubando por uma hora e meia. Nas demais etapas foi utilizado o ExtrAvidin Peroxidase Staining Kit® (Sigma® E-8386), onde adicionou-se o anticorpo secundário biotinizado na diluição 1:15 por 30 minutos. Logo após, os cortes foram incubados por meia hora com o conjugado com extravidina-peroxidase na diluição 1:15. Como solução de lavagem das lâminas entre cada passo foi utilizada TBS 0,05% Tween 20. Todas as incubações foram realizadas em câmara úmida a 37ºC. Por fim, a revelação da reação foi feita com 3-amino-9-dietilcarbazol (AEC) (Sigma®, A-5754) por cinco minutos. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Mayer por dois minutos e examinadas em microscópio ótico. Após a leitura das lâminas, as amostras foram avaliadas quanto à presença ou não de coloração de fundo (background), e classificadas em: negativa (-), ausência de marcação; positiva fraca (+), marcação em menos de 25% do tecido; positiva moderada (++), marcação entre 25 a 50% e positiva forte (+++), marcação em mais de 50% do tecido.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados estão descritos na Tabela 1. Após analisar todas as baterias verificou-se que a RA por microondas + pepsina e microondas + tripsina foram igualmente os melhores tratamentos. Os demais métodos de RA mostraram-se ineficientes. Observou-se que a associação de dois métodos, digestão enzimática e alta temperatura, é essencial para ligação do anticorpo. O formaldeído rompe as pontes de hidrogênio e outras interações eletrostáticas entre aminoácidos e outras moléculas, afetando a conformação das proteínas e promovendo ligações cruzadas (1,3,5). A RA faz-se necessária, pois esta modificação da conformação ou constituição do antígeno pode diminuir ou anular a intensidade da reação final. Suspeita-se que a exposição à proteólise aumenta a permeabilidade do tecido e proporciona a quebra das reações cruzadas, o que facilitaria o acesso dos anticorpos (4). O uso do microondas, combinado com solução iônica, promove mudanças na cinética molecular, gerando calor, o que faz com que ocorra quebra das ligações cruzadas e reversão das conformação das proteínas (3,5). O anticorpo anti p36 mostrou-se melhor na detecção de M. hyopneumoniae, apresentando marcação específica e menor coloração de fundo que o anticorpo anti NrdF. Todas as amostras testadas foram positivas, variando na intensidade de marcação. A imunomarcação ocorreu nos cílios, quando presentes, no epitélio de brônquios e bronquíolos e no exsudato mucocelular dos mesmos. Cabe salientar que a diferença da intensidade de coloração pode variar de acordo com a fase evolutiva da doença, além da qualidade e diluição dos anticorpos usados. Nos controles negativos não foi observado nenhum sinal de marcação.

CONCLUSÃO

A combinação sinérgica da digestão enzimática com alta temperatura em solução iônica aumentou a demonstração de M. hyopneumoniae em pulmão de suínos, quando comparada com outros métodos de RA.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BUSSOLATI, G.; LEONARDO, E. Technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry. J. Clin. Pathol. prelo (http://jcp.bmj.com/cgi/submit).

2. CASTRO, L.A.; SCHUCK, D.; MORES, N.; ZAHA, A.; FERREIRA, H.B.; DRIEMEIER, D. Análise comparativa de anticorpos policlonais monoespecíficos na imunodetecção de Mycoplasma hyopneumoniae em pulmões de suínos. In: 13º CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 13, 2007, Florianópolis. Anais... 2007.

3. LEONG, T.Y.; LEONG, A.S. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. v.14, n.2, p.129-131, 2007.

4. MACINTYRE, N. Unmasking antigens for Br. J. Biomed. Sci. v.58, n.3, p.190-196, 2001.

5. RAMOS-VARA, J.A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet. Pathol. v.42, n.4, p.405-426, 2005.

6. SOBESTIANSKY, J.; RISTOW, L.E.; MATOS, M.P.C.; BARCELLOS, D. Micoplasmoses. In: Sobestiansky, J. & Barcellos, D. (Eds). Doenças dos Suínos. Goiânia: Cânone Editora, p.159-169, 2007.

7. THACKER, E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae. Anim. Health Res. Rev. v.5, n.2, p.317-320, 2004.


Tabela 1. Resultados de IHQ, avaliando cinco técnicas de recuperação antigênica para M. hyopneumoniae, utilizando dois anticorpos diferentes (p36 e NrdF), em 10 amostras de pulmões de suínos.