DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA E AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE LEITÕES DIARREICOS

 

A colibacilose é uma importante enfermidade entérica com impacto significativo na suinocultura. Escherichia coli enteropatogênica destaca-se por sua prevalência em leitões de diferentes faixas etárias, principalmente neonatos, cursando com diarreias e morte (WILLINGER, 1981). Wilson & Francis (1986) e Casey et al. (1992) descreveram cinco principais tipos de fímbrias: K88, K99, 987P, F18 e F41 em isolados de E. coli toxigênicas de origem suína. Essas possibilitam a aderência das bactérias a receptores específicos da superfície dos enterócitos, permitindo que estas secrete toxinas envolvidas no processo de diarreia. O uso indiscriminado de antimicrobianos para controle da colibacilose pode resultar na seleção de bactérias resistentes, o que acarreta na baixa eficiência dos antimicrobianos e na maior necessidade de prevenir a presença de resíduos em produtos de origem animal para o consumo humano (BARCELLOS et al., 2012). O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade hemolítica, presença de fatores de virulência (fímbrias e toxinas) e o padrão de resistência aos antimicrobianos em isolados de E. coli obtidas de leitões com diarreia.

 

Neste estudo foram utilizados 214 isolados de E. coli referentes a diagnósticos clínicos de diarreias em leitões nas fases de maternidade, creche e recria/terminação. Os isolados foram identificados como E. coli pelas características fenotípicas descritas por Quinn et al. (2011). A atividade hemolítica da bactéria foi observada ao cultivo em ágar sangue (5%). A pesquisa de genes que expressam fímbrias (F18, K88, F41 e 987P) e toxinas (STb, StaP, K99, LT e Stx2e) foi realizada pela técnica de PCR multiplex descrita por Casey & Bosworth, (2009), utilizando o Multiplex PCR kit (Qiagen®) para amplificação. Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados em agar Mueller-Hinton pela técnica de difusão em disco e os critérios de interpretação foram obtidos conforme CLSI M31A2. Os antimicrobianos testados foram: ceftiofur, ciprofloxacina, enrofloxacina, marbofloxacina, norfloxacina, colistina, estreptomicina, gentamicina, neomicina, florfenicol, fosfomicina, lincomicina + espectinomicina e tetraciclina. Para avaliar a associação entre a atividade hemolítica bacteriana e fator de virulência, foi aplicado o teste exato de Fisher. O mesmo teste foi utilizado para avaliar a associação entre a ocorrência do fator de virulência e à multirresistência a antimicrobianos. O nível de significância utilizado foi de 5%.

 

Do total de 214 isolados, 92 (43%) apresentaram pelo menos um dos genes relacionado a fatores de virulência. Destas, 27 (29,3%) isolados apresentaram somente genes de toxinas, duas (2,2%) somente genes de fímbrias e 63 (68,5%) apresentaram genes de fímbria e toxina. No estado de Minas Gerais, Macêdo et al. (2007) encontraram índices de 16,6%, 28,6% e 54,8%, respectivamente. A frequência dos fatores de virulência por faixa etária dos leitões estão demonstrados na Tabela 1, na qual observa-se maior frequência do gene Stb (88%) e StaP (76%), corroborando com o estudo de Costa et al. (2006) que encontraram 74% do gene Stb. A atividade hemolítica foi testada em 137 isolados, sendo 48 (35,04%) hemolíticos e 89 (64,96%) não hemolíticos. Destas, 34 (70,83%) e 17 (19,10%) isolados apresentaram pelo menos um fator de virulência com diferença estatística (p<0,0001), respectivamente. Quando discriminado cada fator de virulência, a atividade hemolítica foi associada com a presença de STb, STaP, Stx2e, LT, F18 e K88 (p≤0,05). Sato (2013) encontrou 47,4% de isolados beta hemolíticos e foram associados com F4, F18, StaP e Stx2e. Foi avaliada a sensibilidade antimicrobiana em 49 isolados, positivos para fatores de virulência, sendo 36 (80%) hemolíticos. Este teste demonstrou que o ceftiofur (87,8%), colistina (86,7%) e fosfomicina (88,4%) foram as drogas de melhor eficácia sobre cepas virulentas de E. coli (Figura 1). Observa-se também um alto índice de resistência (83,3%) ao florfenicol, diferente do encontrado por Costa et al. (2006) e Macêdo et al. (2007) que relataram sensibilidade de 81,1% e 89,47% em casos clínicos de diarreia, respectivamente. Dentre os isolados analisados neste estudo, 75,5% apresentaram resistência a pelo menos 3 classes de antibióticos, indicando multirresistência (SCHWARZ et al., 2010). Não foi observada associação (p>0,05) entre a presença dos fatores de virulência com a ocorrência de isolados multirresistentes. Essa alta ocorrência de isolados de E. coli multirresistentes circulando nos rebanhos de suínos, independentemente da presença ou não de fatores de virulência, pode acarretar na transferência de genes entre isolados patogênicos e não patogênicos por transmissão horizontal (Roberts, 2005).

 

Tabela 1 - Distribuição e frequência de fatores de virulência de Escherichia coli enteropatogênica isolada de leitões com diarreias por faixa etária.

 

Figura 1 - Porcentagem de isolados resistentes a antimicrobianos.

 

Com esses resultados, fica evidente a presença elevada de isolados de E. coli patogênicos, caracterizados pela presença de atividade hemolítica e de fatores de virulência de fímbrias e toxinas, em rebanhos de suínos com problemas de diarreias em leitões, principalmente na fase de maternidade. Ainda, foi demonstrada uma alta porcentagem de isolados resistentes e multirresistentes aos principais antimicrobianos utilizados, principalmente à tetraciclina, estreptomicina e florfenicol. Isto demonstra a necessidade de melhorar o controle desse agente com a adoção de melhores práticas de produção dando ênfase no uso racional de antimicrobianos.

 

1. BARCELLOS, D.E.S.N.; SOBESTIANSKY, J.; LINHARES, D., 2012. Uso de antimicrobianos. In: BARCELLOS, D.E.S.N. & SOBESTIANSKY, J. (2Ed.). Doenças dos suínos. Goiania: Canone Editorial, p.837- 884.

2. CASEY, T. A.; BOSWORTH, B. T.; 2009. Design and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction assay for the simultaneous identification of genes for nine different virulence factors associated with E. coli that cause diarrhea and edema disease in swine. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, (21): 25-30.

3. CASEY, T.A.; NAGY, B.; MOON, H.W., 1992. Pathogenicity of porcine enterotoxigenic Escherichia coli that do not express K88, K99, F41 or 987P adhesions. American Journal of Veterinary Research, (53): 1488-1492.

4. CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute).Performance Standards for Antimicrobial disk and dilution susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard – 3nd Ed. M31- A3, vol.28, n.8, 2008.

5. COSTA, M.M.; SILVA, M.A.; SPRICIGO, D.A.; et al., 2006. Caracterização epidemiológica e perfil de resistência aos antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos do sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, (26): 5-8.

6. MACÊDO, N. R.; MENEZES, C. P. L; LAGE, A. P.; et al., 2007. Detecção de cepas patogênicas pela PCR multiplex e avaliação da sensibilidade a antimicrobianos de E. coli isoladas de leitões diarréicos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. (59): 1117–1123, 2007.

7. QUINN, P. J.; MARKEY, B. K.; LEONARD, F. C.; et al., 2011. Enterobacteriaceae. In: Veterinary Microbiology and Microbial Disease. 2ª ed, Ames, Iowa, Wiley-BlackwelL cap. 24, p. 263-286.

8. ROBERTS, M. C.; 2005. Update on acquired tetracycline resistance genes. FEMS Microbiology Letters, 245(2):195–203.

9. SATO, J.P.H., 2013 Frequência e associação de fatores de virulência em amostras de Escherichia coli isoladas de leitões desmamados. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias)-Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 55p.

10. SCHWARZ, S.; SILLEY, P.; SIMJEE, S.; et al., 2010. Editorial: assessing the antimicrobial susceptibility of bacteria obtained from animals. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, (65): 601-604.

11. WILLINGER, H., 1981. Escherichia coli. In: BLOBEL, H. & SCHIESSER, T. (3Ed). Handbuch der bakteriellen Infektionen bei Tieren. Stuttgart, G.: Fischer Verlag, p.257-343.

12. WILSON, R.A.; FRANCIS, D.H., 1986. Fimbriae and enterotoxins associated with E. coli serogroups isolated from clinical cases of porcine colibacillosis. American Journal of Veterinary Research, (47): 213-217.