SOROCONVERSÃO E EXCREÇÃO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA EM LEITÕES INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE

Publicado: 02/08/2016
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Sumário

O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) pertence ao mesmo gênero do vírus da Peste Suína Clássica (PSC), o que torna difícil o diagnóstico viral em suínos devido a possíveis contaminações cruzadas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a soroconversão e excreção de vírus em suínos infectados experimentalmente com BVDV. Para tanto, após a infecção, os animais foram mantidos em um isolador por 18 dias, período no qual foram coletados suabes nasais diariamente e sangue em dias alternados. A soroconversão foi verificada pela técnica de virusneutralização utilizando-se as amostras de sangue e a presença de BVDV nas secreções nasais foi identificada por nested-PCR. Os animais infectados apresentaram soroconversão e excreção do virus pelas vias nasais concomitantemente ao final do experimento. Tais resultados são indicativos da falta de especificidade do BVDV e que suínos podem constituir fonte de infecção do vírus.

 

Palavras-chave: BVDV, virusneutralização, nested-PCR.

 

Introdução

O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) é envelopado, possui genoma composto por RNA de fita simples e polaridade positiva, e pertencente à família Flaviviridae, membro do gênero Pestivirus (DENG et al., 2014). O suíno também é hospedeiro de outros pestivírus, incluindo o vírus da peste suína clássica (VPSC), e vírus da doença da fronteira (BDV) que ocorre em ovinos. Quadros hemorrágicos e leucopenia são comuns em quadros agudos de PSC, e em casos que ocorrem infecção pelo BVDV, estes sintomas causam confusões nas análises para o VPSC. Dessa forma, a confusão na identificação entre os diferentes tipos de vírus pertencentes à mesma família pode ocasionar prejuízos ao produtor (TAO et al., 2013). Leitões infectados congenitamente podem excretar grandes quantidades de vírus e o contato dos mesmos com grande carga viral, ocasiona uma rápida soroconversão com altos títulos de anticorpos (VANNIER et al., 1988; WALZ et al., 1999). A infecção pelo BVDV pode manifestar-se de várias formas clínicas, desde ocasionar sintomas subclínicos até a morte do animal. Alguns estudos mostraram que houve um aumento no nascimento de natimortos e fetos mumificados de fêmeas infectadas com BVBV, e que leitões infectados, de 3 a 4 semanas de idade, morreram subitamente (O‘SULLIVAN et al., 2011). A prevalência da infecção de suínos por BVDV é um fato crescente, cada vez mais frequente e que contribui substancialmente para perdas econômicas na suinocultura mundial (TAO et al., 2013). Sabe-se que a transmissão de BVDV aos suínos requer contato direto destes com ruminantes, entretanto alguns autores alegam que a transmissão do vírus entre suínos não ocorre (LEFORBAN et al., 1992). O fato é que a relação de transmissão real entre suínos ainda permanece desconhecida (TAO et al., 2013). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi identificar o vírus em secreções nasais de leitões desmamados infectados experimentalmente com o BVDV e avaliar a sua resposta sorológica.

 

Material e Métodos

Para o experimento, foram selecionados dois leitões soronegativos, com 21 dias de idade. Os animais foram mantidos em um isolador de aço inoxidável (0,80m x 0,80m x 1,30m), completamente fechado e especialmente projetado para estudos epidemiológicos, desenvolvido por TORREMORELL et al. (1997) e, posteriormente, utilizado por OLIVEIRA et. al. (2010). No dia zero (D0), o vírus da Diarreia Viral Bovina do tipo-1 (BVDV-1), foi inoculado via oronasal, com 2 ml de EMEM (Eagles Minimal Essential Medium), contendo 1x107 TCID50 de BVDV. Foram inoculados 0,5 mL da solução em cada narina dos animais e 1 mL por via oral, simulando uma infecção natural. Os animais foram mantidos no isolador por 18 dias. Assim, amostras de sangue foram colhidas por punção da jugular nos dias D0, D4, D8, D12, D16 e D18. Já os suabes nasais foram coletados diariamente, totalizando 108 amostras. O teste laboratorial utilizado para análise da soroconversão dos leitões foi a virusneutralização (VN). Para tanto, todas as amostras de soro sanguíneo foram testadas em duplicata, com diluições sucessivas de 1:10 até 1:5.120 conforme preconizado pelo ?Manual of Diagnostic Tests and Vaccines of Terrestrial Animals? (OIE, 2009). A detecção da presença do vírus nas secreções nasais foi realizada por nested-PCR. Dessa forma, as amostras de secreções contidas nos suabes foram submetidas à extração de RNA por TRIZOL® (Invitrogen) e obtenção do cDNA pelo kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). A identificação do vírus foi realizada utilizando-se o conjunto de primers desenvolvido por WEINSTOCK et al. (2001) para amplificação de uma banda de 289 pb. A reação de PCR e de nested-PCR foram compostas por tampão 1X (20 mM Tris-HCl pH 8,4; 50 mM KCl), 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1,0 U Taq DNA polimerase, 5 pmol de cada primer, 5 μL de cDNA, na primeira reação PCR e 5 μL de produto da PCR na reação de nested-PCR, e água suficiente para completar 20 μL de solução. A amplificação do fragmento foi realizada em um termociclador Veriti (Eppendorf) programado para realizar um ciclo a 95°C por 4 minutos, 35 ciclos a 94°C por 40 segundos, 60°C por 40 segundos e 72°C 40 segundos, seguido de um ciclo final de 72°C por sete minutos. Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) em um equipamento de fotodocumentação GELDOC XR (BioRad).

 

Resultados e Discussão

Os leitões apresentaram soroconversão no décimo sexto dia (D16) do período experimental, sendo que um dos leitões apresentou titulação viral de 1x10-5 e outro de 1x10-7. No entanto, a presença do vírus na secreção nasal foi detectada no décimo sétimo dia (D17) do period experimental pela nested-PCR. Tais resultados demonstraram que o período a excreção do virus ocorreu logo após a soroconversão. Walz e colaboradores (1999) obtiveram resultados semelhantes, onde inocularam o BVDV em leitões de dois meses e obtiveram resultado positivo para o BVDV-1 em amostras de sangue.

 

Conclusões

Leitões infectados com BVDV soroconverteram e excretaram o vírus, podendo assim constituir fontes de infecção.

 

Agradecimentos

O apoio financeiro prestado pela concessão 2014 / 13590-3, Fundação de Pesquisa de São Paulo (FAPESP).

 

Referências Bibliográficas

1. DENG, Y.; SHAN, T.; TONG, W.; ZHENG, X.; GUO, Y.; ZHENG, H.; CAO, S.; WEN, X.; TONG, G. 2014. Genomic characterization of a bovine viral diarrhea virus 1 isolate from swine. Archives of Virology, 159:2513-2517.

2. LEFORBAN, Y.; VANNIER, P.; CARIOLET, R. 1992. Protection of piglets born from ruminant pestivirus experimentally infected sows and their contact, to the challenge with hog cholera virus. Annales De Recherches Veterinaires, v. 23, p. 73–82.

3. OIE. Organização Mundial de Saúde Animal. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012. Disponível em: <http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.08_BVD.pdf> Acesso em: 09 mar. 2013.

4. OLIVEIRA, L. G.; CARVALHO, L. F. O. S.; MASSON, G. C. I. H.; FELICIANO, M. A. R. 2010. Infecção experimental por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Panama e tentativa de transmissão nasonasal em leitões desmamados. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.62, n.6, p.1340-1347.

5. VANNIER, P.; LEFORBAN, Y.; CARNERO, R.; CARIOLET, R. 1988. Contamination of a Live Virus Vaccine Against Pseudorabies (Aujeszkys Disease) by an Ovine Pestivirus Pathogen for the Pig. Annales De Recherches Veterinaires, 19:283-290.

6. TAO, J.; LIAO, J.; WANG, Y.; ZHANG, X.; WANG, J.; ZHU, G. 2013. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) infections in pigs. Veterinary Microbiology, v.165, a.2013, p.185-189.

7. TORREMORELL, M; PIJOAN, C; JANNI, K; WALKER, R; JOO, H. S. Airborne Transmission of Actinobacillus Pleuropneumoniae and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Nursery Pigs. American Journal of Veterinary Research, a.58, v.8, p.828-832. 1997.

8. WALZ, P. H.; BAKER, J. C.; MULLANEY, T. P.; KANEENE, J. B.; MAES, R. K. 1999. Comparison of Type I and Type II Bovine Viral Diarrhea Virus Infection in Swine. Canadian Journal of Veterinary Research, v.63, p.119-123.

9. WEINSTOCK, D.; BHUDEVI, B.; CASTRO, A. E. 2001. Single-tube single-enzyme reverse transcriptase PCR assay for detection of bovine viral diarrhea virus on pooled bovine serum. Journal of Clinical Microbiology, p.343-346, v.39, n.1.


***O TRABALHO FOI ORIGINALMENTE APRESENTADO DURANTE O XVII CONGRESSO ABRAVES 2015- SUINOCULTURA EM TRANSFORMAÇÂO, ENTRE OS DIAS 20 e 23 DE OUTUBRO, EM CAMPINAS, SP.

 
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