O PLASMA SEMINAL DA FRAÇÃO RICA ALTERA A FLUIDEZ DE MEMBRANA PÓS DESCONGELAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO

Publicado: 09/01/2017
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Sumário

O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da centrifugação e da adição de 10% de plasma seminal (PS) aos espermatozoides suínos criopreservados, sobre a desordem lipídica  das membranas. A partir da fração rica de quatro ejaculados de seis cachaços (n=24), foram realizados os seguintes tratamentos: não centrifugado (NC), centrifugado suspendido (CR), centrifugado sem plasma seminal (CS) e centrifugado adicionado de 10% de PS ao meio de descongelação (CP), o qual foi originado de CS, após descongelação e adição de 10% de PS obtido durante a centrifugação. Após a descongelação, as células foram submetidas à citometria de fluxo e analisadas quanto à fluidez de membrana (Merocianina 540). Os dados obtidos foram analisados por comparação de médias (Tukey - SAS) ao nível de 5% de probabilidade. A partir dos resultados obtidos conclui-se que a adição de plasma seminal após a descongelação é capaz de reduzir a criocapacitação, uma vez que, diminui a desordem lipídica da membrana espermática.

 

Palavras-chave: desordem lipídica; merocianina; criocapacitação.

 

Introdução

A congelação do sêmen suíno permite a difusão e conservação de doses inseminantes de alto valor genético e apresenta-se como uma alternativa para as situações nas quais o movimento de animais é restrito, por esse motivo o alcanço do sucesso na criopreservação pode representar um importante avanço no sistema de produção de suínos (BAILEY et al., 2008). As modificações geradas nas membranas espermáticas, durante as etapas da congelação e descongelação do sêmen, assemelham-se às ocorridas durante a capacitação. Esta “criocapacitação” é frequentemente citada como um dos fatores associados à redução da longevidade do espermatozoide criopreservado no trato reprodutivo da fêmea suína (VADNAIS et al., 2005). Assim, a membrana plasmática representa relevante papel na capacidade fertilizante destas células (WATSON, 1995) e deve-se apresentar-se íntegra física e funcionalmente (PARKS e GRAHAN, 1992). Com o choque térmico, ocorre o aumento da fluidez dos lipídios da membrana do espermatozoide suíno (JOHNSON et al., 2000), aumentando a permeabilidade da membrana espermática. A adição do plasma seminal ao sêmen pósdescongelação tem a capacidade de reduzir os efeitos deletérios da congelação já que reduz o número de espermatozoides capacitados e/ou com acrossomo reagido em suínos (VADNAIS et al., 2005) e melhora a viabilidade, em equinos (DE ANDRADE et al., 2011). Na espécie suína, antes de se submeter o sêmen à congelação realiza-se a centrifugação com posterior retirada do plasma seminal para promover o aumento da concentração dos espermatozoides, o qual é essencial para permitir o envasamento (CARVAJAL et al., 2004). O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da centrifugação e da adição de 10% plasma seminal (PS) aos espermatozoides suínos criopreservados, sobre a desordem lipídica das membranas.

 

Material e Métodos

Coletou-se a fração rica de 4 ejaculados de seis cachaços (n=24), que foram separados entre os tratamentos (não centrifugado-NC, centrifugado suspendido-CR e centrifugado sem plasma seminal-CS). CR e CS foram centrifugados a 500x g/10 min. CR foi suspendido em próprio PS, já em CS o sobrenadante (PS) foi retirado, centrifugado novamente (2500x g/30min) e filtrado à vácuo sob película de 0,2 μm e armazenado em -80°C para posterior utilização. O sedimento de CS, bem como CR e NC foram diluídos em diluente de criopreservação, à base de gema de ovo, para concentração de 300x106 espermatozoides/mL, envasados em palhetas de 0,5 mL e criopreservados em sistema automático respeitando a curva: -0,5°C/min até 5°C; -20°C/min até -120°C; e imersão em nitrogênio líquido (-196°C). Duas palhetas de cada tratamento foram imersas em banho-Maria à 37°C/30seg, e diluídas em uma proporção 1:1 em diluente de criopreservação. O tratamento centrifugado adicionado de PS (CP) originou-se de CS com adição de 10% de PS (obtido durante a centrifugação) ao meio de descongelação (v:v). As análises foram realizadas após 5, 60 e 120min de incubação a 37°C, em cada tempo, uma alíquota foi diluída em meio TALP para concentração de 5 x 106sptz/mL e corada com 2μL de Hoechst 33342 (2,5 mg/mL) e incubada a 37°C/10min, adicionou-se 0,5μL de Yo-Pro1 (7,5 μM), incubado a 37°C/20min, e 0,5μL de Merocianina 540 (810 μM) foi adicionado e incubado a 37°C/70seg. Após esse tempo, as células foram diluídas 1:1 em TALP e submetidas citometria de fluxo. As células viáveis (Yo-Prol 1 negativas) foram analisadas quanto à intensidade de fluorescência de Merocianina 540 captada pelo fotomultiplicador long-pass 596 e bandpass 610/20. Os dados foram analisados usando o procedimento MIXED (SAS, 2002) contendo os tratamentos como os principais fatores. Cada animal foi considerado uma unidade experimental. Os efeitos dos tratamentos foram analisados utilizando o procedimento misto Tukey- Kramer SAS. Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05 e os resultados foram apresentados em média ± EPM.

 

Resultados e Discussão

A membrana espermática é o principal local da lesão causada pelo proceso de criopreservação (MAZUR, 1984). As células espermáticas são notoriamente sensíveis ao congelamento resultando na diminuição da motilidade e no aumento de danos na membrana plasmática (SARAIVA et al., 2005), como o aumento da fluidez da membrana. Diversos estudos relataram que estes danos podem ser reduzidos pela adição de plasma seminal ao meio de descongelação em espermatozoides de equinos (ANDRADE et al., 2011), carneiros (MAXWELL et al., 2005), e suínos (CABALLERO et al., 2004). Tais resultados corroboram com os obtidos no presente trabalho, no qual a ausência de plasma seminal aumentou (p < 0,05) a desordem lipídica da membrana espermática, entretanto, esta alteração foi revertida (p < 0,05) com a adição de 10% de plasma seminal autólogo no meio de descongelação do sêmen suíno, aumentando a estabilidade da membrana plasmática quando avaliados em citometria de fluxo.

 

Figura 1 - Média ± erro padrão da média da Intensidade de fluorescência analisada por citometria de fluxo da variável desordem lipídica da membrana plasmática (DM). NC: não centrifugado, CR: centrifugado suspendido, CS: centrifugado sem plasma seminal, CP: centrifugado adicionado de plasma seminal. Letras diferentes representam diferença estatística entre as médias (p < 0,05).

 

Conclusão

Assim temos que a adição de 10% de plasma seminal no meio de descongelação é capaz de diminuir a desordem lipídica das membranas e que sua ausência é deletéria para a fluidez das membranas e o processo de centrifugação pré-congelação não foi prejudicial. Esses resultados nos permitem inferir que a adição de plasma seminal após a descongelação é capaz de reduzir a criocapacitação, uma vez que, diminui a desordem lipídica da membrana espermática. Agradecimentos - À Agroceres Multimix®, à Botupharma®, à FAPESP Processo 2011/23484-8 e 2013/08070-8 e à PIBIC-CNPq Processo 146574/2014-1 pelo apoio durante a execução deste experimento.

 

Referências Bibliográficas

1. BAILEY, J.L.; LESSARD, C.; JACQUES, J.; BRÈQUE, C.; DOBRINSKI, I.; ZENG, W.; GALANTINO-HOMER, H.L; 2008. Cryopreservation of boar semen and its future importance to the industry. Theriogenology, (70): 1251-1259.

2. CABALLERO, I.; VAZQUEZ, J.M.; CENTURIÓN, F.; RODRÍGUEZ-MARTINEZ, H.; PARRILLA, I.; ROCA, J.; CUELLO, C.; MARTINEZ, E. A.; 2004. Comparative effects of autologous and homologous seminal plasma on the viability of largely extended boar spermatozoa. Reprod. Domest. Anim. (39): 370–375.

3. CARVAJAL, G.; CUELLO, C.; RUIZ, M.; VÁSQUEZ, J.M.; MARTÍNEZ, E.M.; ROCA, J; 2004. Effects of centrifugation before freezing on boar sperm cryosurvival. Journal of Andrology, (25): 389-396.

4. DE ANDRADE, A. F. C.; ZAFFALON, F. G.; CELEGHINI, E. C. C.; NASCIMENTO, J.; TARRAGÓ, O. F. B.; MARTINS, S. M. M. K.; ALONSO, M. A.; ARRUDA, R. P; 2011. Addition of seminal plasma to post-thawing equine semen: What is the effect on sperm cell viability? Reproduction in Domestic Animals, (46): 682-686.

5. JOHNSON, L.A.; WEITZE, K. F.; FISER, P.; MAXWELL, W.M.; 2000. Storage of boar semen. Anim Reprod Sci, (62): 143-172.

6. MAXWELL, W. M. C.; WELCH, G. R.; JOHNSON, L. A.; 1996. Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma. Reprod Fertil Dev, (8): 1165–1178.

7. MAZUR, P.; 1984. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. Cell. Physiol, (247): 125-142.

8. PARKS, J.E.; GRAHAN, J.K.; 1992. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, (38): 209-222.

9. SARAVIA, F.; WALLGREN, M.; NAGY, S.; JOHANNISSON, A.; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H.; 2005. Deep freezing of concentrated boar semen for intra-uterine insemination: Effects on sperm viability. Theriogenology, (63): 1320–1333.

10. VADNAIS, M. L.; KIRKWOOD, R. N.; SPECHER, D. J.; CHOU, K.; 2005. Effect of extender, incubation temperature, and added seminal plasma on capacitation of cryopreserved, thawed boar sperm as determined by chlortetracycline staining. Animal Reproduction Science, (90): 347-354.

11. WATSON, P. F.; 1995. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev, (7): 871-891.

 

***O TRABALHO FOI ORIGINALMENTE APRESENTADO DURANTE O XVII CONGRESSO ABRAVES 2015- SUINOCULTURA EM TRANSFORMAÇÂO, ENTRE OS DIAS 20 e 23 DE OUTUBRO, EM CAMPINAS, SP.

 
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