nutrição bovina

A alfafa (Medicago sativa L.) foi segada no verão com 40 dias de rebrote no estádio de início de florescimento (26,3%  MS;18,94% PB; 8,9% de carboidratos solúveis na MS; e 43,35 meqOH-/100 g de MS de poder tampão). Parte do material foi ensilada fresca(26,30% MS) e parte, emurchecida por 20 horas (44,12% MS). Ambas as silagens, emurchecidas e não-emurchecidas, foram submetidasa quatro tratamentos, Controle, Enzimas, Lactobacilos e Lactobacilos mais Enzimas, e ensiladas em silos de laboratório (3,6 L), com quatrorepetições por tratamento, por um período de 60 dias. O emurchecimento propiciou silagens de melhor qualidade com menor pH, maiorrelação ácido lático/ácido acético, menores níveis de N amoniacal (N - NH3) e menor solubilização das frações nitrogenadas, com maior teorde carboidratos solúveis residuais. A ação dos aditivos na silagem de alfafa não-emurchecida determinou valores mais baixos de pH e NNH3 nos tratamentos com Enzimas e Lactobacilos mais Enzimas, quando comparados com o tratamento Lactobacilos, mas que não diferiramdo Controle. Em ambas as silagens fresca e emurchecida, houve diminuição do nível de FDN no tratamento Lactobacilos mais Enzimas.

Palavras-chave: emurchecimento, enzimas, lactobacilos, silagem de alfafa 

A 40 days alfalfa (Medicago sativa) regrowth was harvested in the summer at the early flowering stage with (26.3%DM, 18.94% CP, 8,90% DM soluble carbohydrates and 43.35 meq OH-/100 g DM buffering capacity). Part of the material was directcut ensiled (26.3% DM) and part was wilted for 20 hours (44.12% DM). Both silages, either wilted or not, were assigned to fourtreatments: Control, Enzymes, Inoculate and Inoculate plus Enzymes and were ensiled in laboratory silos (3.6 L), with four replicates,per treatment, per a period 60 days. Wilting provived silages of better quality with  lower pH, higher lactic acid/acetic acid ratio, lowerN-NH3 and lower solubilization of the nitrogen fraction, with higher residual soluble carbohydrates content. The direct cut alfalfa silagesadditive action provided lower pH and N-NH3 in the treatments with Enzymes and Inoculate plus enzymes when compared to thetreatment with Inoculate, however when compared to the treatment with Inoculate, but did not differ from Control. In both silages (directcut and wilted), there was a decrease in the NDF contents in the Inoculates plus Enzymes treatment.

Key Words: alfalfa silage, enzymes, inoculate, wilting 

Em alguns sistemas de produção, a qualidade dovolumoso disponível para os rebanhos tem limitado odesempenho animal. Devido a esta situação, temocorrido aumento na demanda por informações sobrealimentos volumosos de maior valor nutritivo, capazes de atender às necessidades nutricionais de animais de alto potencial genético ou de categorias demaiores exigências nutricionais e reduzir os custos deprodução, diminuindo a necessidade de suplementaçãocom concentrados.A alfafa (Medicago sativa L.) destaca-se dasdemais forrageiras pela qualidade nutricional, produtividade, palatabilidade, digestibilidade e capacidadede fixação de nitrogênio (BARNES et al., 1988). Autilização da alfafa pode ser feita nas formas de feno,silagem, pastejo ou forragem fresca ofertada aosanimais no cocho (BOTREL e ALVIM, 1994). Aconservação da alfafa na forma de silagem permiteutilização mais racional, sob vários aspectos: econô-mico, por apresentar menores perdas de matériaseca; nutricional, pela menor perda de nutrientesdurante a conservação; e de manejo, por favorecer ofornecimento em dietas totalmente misturadas.A alfafa no estádio de início de florescimentoapresenta as melhores características nutricionais,contudo, a maior limitação na utilização da alfafa refere-se à degradação da proteína em nível ruminale ao seu aproveitamento pelo animal, quando da suaconservação como silagem (PICHARD e RYBERT,1993). Outros fatores que contribuem para a dificuldade de conservação da alfafa na forma de silagemsão relativos à baixa concentração de matéria seca eao elevado teor de proteína e de matéria mineral nomomento do corte que a caracterizam como forrageirade difícil ensilagem, pois apresenta elevada capacidade tamponante (MELVIN, 1965; MUCK eWALGENBACH, 1985) e baixos níveis decarboidratos solúveis (MELVIN, 1965). 

Nesse sentido, o uso de aditivos biológicos(enzimas e lactobacilos) e o emurchecimento têmsido propostos como formas de oportunizar melhoresresultados no processo fermentativo de silagens.Vários experimentos utilizando inoculantesmicrobianos têm demonstrado efeitos positivos naqualidade de silagens, evidenciados por diminuiçãoda proteólise inicial, aumento da taxa de declínio depH, redução do pH final, aumento da produção deácido lático e diminuição do nitrogênio não-protéico(NNP) solúvel, o que assegura melhor qualidadefermentativa (JONES et al., 1992). Experimentosanalisando o efeito da adição de enzimas em silagensde alfafa têm apresentado resultados semelhantes,alguns porém com incremento do NNP solúvel(HRISTOV, 1993). A utilização conjunta delactobacilos e enzimas (celulase, hemicelulase,pectinase etc.) têm apresentado resultados controvertidos; alguns autores citam efeitos positivos nosparâmetros fermentativos (WOOLFORD, 1984;SHEPERD et al., 1995) e outros indicam a possibilidade de ações antagônicas (STOKES, 1992). Outrostrabalhos têm constatado pouco efeito de inoculantesmicrobianos e aditivos enzimáticos sobre a eficiênciada fermentação de silagens de alfafa (WHITE et al.1990), sugerindo que a inoculação com bactériasformadoras de ácido lático somente seria efetivaquando suplementada com carboidratos solúveis ouainda com aumento dos níveis de MS (VALINOTTIe PICHARD, 1993). O emurchecimento exerce efeito de concentração de substrato, que, juntamentecom aumento do potencial osmótico, dificulta o desenvolvimento de bactérias, principalmente dosclostrídios proteolíticos, que são mais sensíveis epermitem a dominância de bactérias láticashomofermentativas, o  que  possibilita rápido declíniodo pH e menor extensão da fermentação(WOOLFORD, 1984). Por outro lado, oemurchecimento demasiado pode propiciar o desenvolvimento de fungos e aquecimento do material nosilo com efeitos deletérios na qualidade do processofermentativo e do alimento (WOOLFORD, 1984).Considerando-se as potencialidades da alfafa,suas vantagens e limitações para ensilagem e procurando viabilizar e melhorar as condições para oprocesso fermentativo, foi objetivo deste trabalhoverificar o efeito do emurchecimento e do uso deaditivos biológicos na qualidade da silagem produzida.

O segundo corte de um cultivo de alfafa com 40dias de rebrote, feito em área cedida pela Cooperativa Agrícola Mista General Osório (COTRIBA), nomunicípio de Ibirubá-RS, foi empregado para a realização do experimento. A alfafa foi cortada comsegadeira de disco no estádio de início deflorescimento. Após o corte, o material foi separadoem duas porções semelhantes: a primeira foi imediatamente recolhida e picada com ensiladeira (tamanhode partícula entre 1 e 1,5 cm) e a segunda permaneceu a campo por 20 horas para emurchecimento.Após a picagem, cada material foi totalmentehomogeneizado, pesado e subdividido em quatro por-ções iguais, com a finalidade de receber a aplicaçãodos tratamentos. A primeira porção de ambos materiais (fresco e emurchecido) foi ensilada, sem adiçãode aditivos, para compor o tratamento controle. Asegunda porção foi tratata com aditivo enzimático, naforma de pó, Allzyme-ALLTECH (complexoenzimático de celulases, hemicelulases, pentosanasese amilases), aplicando-se dose de 500 gramas portonelada de material fresco ou emurchecido. A terceira porção foi tratada com o inoculante 1174-PIONEER (com 9X107 UFC/g de  Lactobacillusplantarum e Streptococcus faecium), sendo a doseaplicada de 1,1 g de produto diluído em 2 litros de águadestilada por tonelada de material fresco ouemurchecido. A quarta porção foi tratada com oinoculante Sill-All-ALLTECH (com 2 x 1010 UFC/gde Lactobacillus plantarum, Streptococcus faeciume  Pediococcus acidilatici, além de complexoenzimático com celulases, hemicelulases,pentosanases e amilase), sendo aplicada a dose de 10g de produto diluído em 2 litros de água destilada portonelada de material fresco ou emurchecido. Asdoses aplicadas seguiram as recomendações dosfabricantes. Dessa forma, os tratamentos ficaramassim constituídos: C - sem inoculante (controle), E -com Enzimas, L - com Lactobacilos e LE - com Lactobacilos mais Enzimas. 

O aditivo enzimático foi aplicado manualmentesobre a forragem, enquanto os outros dois inoculantesforam aspergidos sobre a forragem com o auxílio deuma bomba de aspersão manual. O material foiconstantemente revolvido durante a aplicação dosaditivos e, para evitar a contaminação entre os tratamentos, foi utilizado uma lona plástica individual, bemcomo uma bomba de aspersão, para cada um dostratamentos. Para a ensilagem do material, foramutilizados, como silos experimentais, 32 baldes plásticos de 19 cm de altura e 17,5 cm de diâmetro, comcapacidade para 3,6 litros. Os silos foram compactadosem camadas de 3 a 5 cm, procurando manter padrãohomogêneo de compactação entre os tratamentos,sendo então fechados com tampas, identificados,hermeticamente vedados com fita adesiva e realizadapequena incisão para drenagem de eventual efluente.As amostragens do material original foram tomadas logo após a picagem da alfafa, fresca ouemurchecida, no momento em que o material foitotalmente homogeneizado e pesado. Nesse momento, foram retiradas duas amostras de aproximadamente 700 g, as quais foram conservadas em baixatemperatura (5ºC) e logo após congeladas (-14oC)até o processamento laboratorial. 

As amostragens das silagens foram feitas no finaldo período de fermentação, que teve duração de 60dias. Na coleta das amostras, foram desprezados os5 cm da porção superior e inferior dos silos. Asamostras foram acondicionadas em sacos plásticos,vedadas, identificadas e congeladas (-14oC).Para determinação de laboratório, as amostras dealfafa, fresca e emurchecida, tomadas logo após apicagem, foram processadas em liqüidificador antesde ocorrer o descongelamento. Após este procedimento, o material foi homogeneizado e sub-amostrado.Duas sub-amostras foram empregadas na determina-ção do poder tampão (PT), segundo a técnica descrita por PLAYNE e McDONALD (1966). Uma subamostra de 250 g foi seca em estufa de ar forçado a55oC até peso constante (72 h) e moída em moinhotipo Willey com peneira de crivo de 1,0 mm. Nestematerial, foram efetuadas determinações de matériaseca (MS), a 105oC, matéria mineral (MM) e nitrogê-nio total (PB), pelos métodos descritos pelaASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICALCHEMISTS - AOAC (1995). Ainda neste material,foram determinados o teor de glicídios solúveis(CHOsol), como descrito por DUBOIS et al. (1956),e as concentrações de fibra em detergente neutro(FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e lignina emdetergente ácido (LDA), segundo método descritopor GOERING e VAN SOEST (1970). As fraçõesnitrogenadas, nitrogênio insolúvel em solução tampão(Ninsol), nitrogênio insolúvel em detergente neutro(NIDN), nitrogênio insolúvel em detergente ácido(NIDA), foram estimadas segundo as técnicas descritas por KRISHNAMOORTHY et al. (1982).

As amostras de silagens congeladas a -14ºCtambém foram processadas em liqüidificador,homogeneizadas e sub-amostradas. As análises realizadas foram: MS por destilação com tolueno e PB,segundo os métodos descritos pela AOAC (1995);pH, medido em potenciômetro, a partir de um extratode silagem obtido do filtrado de 50 g de silagem, apóster sido triturada em liqüidificador e misturado com200 mL de água destilada; CHOsol, como descritopor DUBOIS et al. (1956); FDN, FDA e LDA,medidos segundo método descrito por GOERING eVAN SOEST (1970); as frações nitrogênio insolúvelem solução tampão (Ninsol), nitrogênio insolúvel emdetergente neutro (NIDN) e nitrogênio insolúvel emdetergente ácido (NIDA), segundo as técnicas descritas por KRISHNAMOORTHY et al. (1982); nitrogê-nio amoniacal (N-NH3), medido segundo o método deVOIGT e STEGER (1976); e os teores de ácidosgraxos voláteis (AGV) e ácido lático, medidos porcromatografia gasosa em extrato aquoso de silagens,conforme método descrito por BÖTTCHER (1982).Foi empregado um delineamento completamenteao acaso com arranjo fatorial, composto por doisfatores, umidade (emurchecido e não-emurchecido)e aditivos (controle, enzimas, lactobacilos e lactobacilosmais enzimas), totalizando oito tratamentos, cada umcom quatro repetições. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadaspelo teste Tukey. As análises foram executadas peloSistema de Análise Estatística paraMicrocomputadores - SANEST (ZONTA eALMEIDA, 1985). 

Características químico-bromatológicas da alfafafresca ou submetida ao efeito de emurchecimentoOs níveis de MS e CHOsol e o PT são elementosimportantes no processo fermentativo (MELVIN,1965; WOOLFORD, 1984) e apresentam alterações,devido ao emurchecimento. O conteúdo de MS nomaterial fresco foi superior a 25% (Tabela 1), considerado, por WOOLFORD (1984), como nível mínimo para se obterem silagens com fermentação de qualidade. Contudo, a baixa concentração de CHOsol e oelevado PT caracterizam a alfafa fresca como umaforragem de difícil conservação, pelo processo deensilagem, o que foi observado também em avaliaçõesfeitas por MELVIN (1965) e JONES et al. (1992).O emurchecimento determinou, além do aumentono teor de matéria seca, diminuição de aproximadamente 20% na concentração de carboidratos solúveis(CHOsol) na MS e aumento de aproximadamente25% no poder tampão (PT) (Tabela 1). Contudo, oaumento na concentração da MS, principalmente daporção solúvel, aumenta a tensão osmótica do meio,o que irá contribuir para condição favorável ao processo fermentativo de boa qualidade (KUNG JR. etal., 1984; JONES et al., 1992).Na fração fibrosa, não houve alteração, à exce-ção da fração hemicelulose, que apresentou teor,aproximadamente, 11% inferior ao da alfafa fresca.O teor de proteína bruta (PB) foi semelhanteentre as alfafas fresca e emurchecida (Tabela 1),mesmo considerando certa perda de folhas observada durante o processo de emurchecimento. As fra-ções de nitrogênio insolúvel (N-insol) e nitrogênioinsolúvel em detergente ácido (NIDA) não indicaramalterações marcantes (Tabela 1). Já a fração nitrogê-nio insolúvel em detergente neutro (NIDN) foi aproximadamente 27% inferior na alfafa emurchecida,quando comparada com a alfafa fresca (Tabela 1), oque poderia ser explicado pela ação de enzimasendógenas no período inicial do emurchecimento. 

A reduzida produção de efluente constatada somente nos primeiros dias de fermentação das silagensfrescas não afetou os teores de MS, PB, NIDA,lignina (Tabela 2) e celulose (Tabela 4) das silagens,quando comparadas com os valores do material original (Tabela 1), o que ocorreu em função de o teorde MS no material fresco ter sido próximo a 30%,considerado por WOOLFORD (1984) como limitepara a produção de efluentes em silagens. Os valoressimilares de NIDA refletem a inexistência de forma-ção de complexos de Maillard nas silagensemurchecidas em comparação às frescas (YU eTHOMAS, 1976). Por outro lado, os teores de CHOsol,N-insol, NIDN, FDN e hemicelulose nas silagensforam inferiores aos do material original, indicando aocorrência de hidrólise destas frações durante oprocesso fermentativo, também observado por PITT(1990) e PICHARD e RYBERT (1993). 

O emurchecimento, além de aumentar o teor deMS, determinou maior concentração de CHOsolresiduais (P<0,01) e maior preservação das fraçõesN-insol e NIDN (P<0,01) nas silagens (Tabela 2).Os teores de N-insolúvel em solução tampão nassilagens foram, aproximadamente, 40 e 28% inferiores em relação aos materiais fresco e emurchecido,respectivamente. A solubilização do NIDN dassilagens em relação ao material original foi 57 e25%, respectivamente, nas silagens fresca eemurchecida. Outros trabalhos confirmam a diminuição da proteólise, com o aumento do teor de MS(MUCK, 1987; JONES et al., 1992; e PICHARD eRYBERT, 1993). A fração NIDA e os conteúdosde hemicelulose e lignina das silagens não foramafetados pelo emurchecimento (Tabela 2).Os teores médios de FDN das silagens frescase emurchecidas (Tabela 3) foram, aproximadamente, 10% inferiores ao dos materiais de origem(Tabela 1). O aditivo LE resultou no menor conteú-do de FDN e foi diferente dos tratamentos C e L(P<0,01); já o tratamento E não apresentou diferença dos demais. A solubilização do NIDN nassilagens C, E, L e LE foi de, aproximadamente,43% em relação ao material original.

Nenhum dosaditivos utilizados resultou em menor solubilizaçãode NIDN em relação ao tratamento C. Contudo, oaditivo E apresentou maior solubilização da fraçãoNIDN que os tratamentos L e LE (P<0,05), provavelmente devido à degradação da fração FDNcausada por enzimas fibrolíticas ou pela ação deproteases presentes no complexo enzimático. Entretanto, ocorreu também diminuição nos teores deFDN no tratamento LE, sem decréscimo correspondente na fração NIDN, o que parece indicarque as enzimas presentes nestes produtos apresentam sítios de ação diferenciados na degradação daparede celular (Tabela 3).Em relação às variáveis FDA e celulose, houveefeito da interação entre os fatores umidade eaditivos (Tabela 4), sendo que nas silagensemurchecidas os aditivos não apresentaram efeito,mas nas silagens de alfafa fresca os tratamentosLE e E apresentaram concentrações inferiores ao L(P<0,05), não diferindo, porém, do C. O tratamento Lapresentou maior concentração de FDA e celulosenas silagens frescas em relação às emurchecidas(P<0,05), bem como menor hidrólise da parede celular em comparação aos tratamentos LE e E nassilagens frescas, demonstrando atividade enzimáticamenos intensa, provavelmente, associada àinexistência de enzimas fibrolíticas no aditivo.Nas silagens emurchecidas, as condições do meionão favoreceram a ação dos aditivos sobre essasvariáveis, mas possibilitaram fermentação adequada(Tabela 5), o que também foi observado por KUNGJR. et al. (1984) e GARCIA et al. (1989). 

 

A qualidade das silagens pode ser avaliada pelopH e pelos produtos finais de fermentação, comoácidos orgânicos e proporção de N-NH3O .emurchecimento da alfafa determinou maior propor-ção de ácido lático em relação ao ácido acético(Tabela 5). Não foi constatado efeito, devido aosaditivos sobre a produção de ácidos de fermentação.Apesar de não serem apresentados, os teores deácido butírico encontrados nas silagens frescas foram inferiores a 0,01% da MS, apresentando pequena participação na concentração de ácidos totais(P<0,01), demonstrando a ausência de fermentaçãoclostrídica nas silagens produzidas. Houve interaçãodos fatores umidade e aditivos em relação às variá-veis pH e N-NH3 (Tabela 6). O pH das silagensemurchecidas não apresentou diferença entre os aditivosutilizados e foi sempre inferior ao das silagens frescas(P<0,05). Por outro lado, nas silagens frescas, ocorreuefeito nos tratamentos E e LE, que apresentaram menorpH que o L (P<0,05), sem diferirem, contudo, do tratamento controle. A proporção de N-NH3 em relação aoN total também foi menor nas silagens emurchecidas(P<0,05). Por outro lado, nas silagens frescas, o tratamento E determinou menor produção de N-NH3 (P<0,05),quando comparado aos tratamentos L e C, mas semapresentar diferenças em relação a LE.Os resultados obtidos neste experimento indicamque o emurchecimento da alfafa produziu silagenscom melhor qualidade fermentativa, caracterizadapela melhor relação entre os ácidos lático e acético, por menor pH, menor proporção de N-NH3 e maiorconcentração de CHOsol residuais. Estes resultadosvêm de encontro aos obtidos por KUNG JR. et al.(1984) e GARCIA et al. (1989), exceto pela maiorconcentração de ácido lático nas silagens, com maiorteor de MS do presente estudo.  

Os resultados devários experimentos com silagens de alfafa têm demonstrado que o emurchecimento diminui a extensãoda fermentação, produzindo silagens com menoresteores de ácido lático e AGV totais, maior pH final deestabilização (KUNG JR. et al., 1984; GARCIA etal., 1989; e JONES et al., 1992), além de proporcionarmaior presença de CHOsol residuais (KUNG JR. etal., 1984) e, em muitos casos, aumentar a proporçãode ácido lático em relação ao acético (GARCIA etal., 1989). Da mesma forma, KUNG JR. et al. (1984)e GARCIA et al. (1989) encontraram menor produ-ção de N-NH3 em silagens de alfafa emurchecidas.As silagens frescas apresentaram limitação da fermentação, com baixa produção de ácido lático, provavelmente devido à escassez de substrato (2,34% deCHOsol na matéria fresca), sem, contudo, resultarem fermentação clostrídica, o que pode estar associado à concentração de MS. Por outro lado, nassilagens emurchecidas, a disponibilidade de substratoparece não ter sido limitante e as condições defermentação foram adequadas em todos os tratamentos, resultando inclusive em pH final inferior aodas silagens frescas, o que normalmente não tende aocorrer com material emurchecido. Esta constataçãotambém foi feita por PITT et al. (1985), que consideram a alfafa ensilada com alto teor de MS como ummaterial que dificilmente apresenta limitações desubstrato. Nas silagens frescas, em que as condiçõespara fermentação foram mais limitadas, devido àbaixa diponibilidade de substrato, somente o tratamento E apresentou teor relativo de N-NH3 inferioràs silagens C e L, sem diferir, contudo, do LE. Esteresultado indica maior capacidade de produzirsubstrato adicional para a fermentação, por intemédioda hidrólise da fração celulose da parede celular(Tabela 4), também caracterizado pelo menor pHobservado neste tratamento. Os resultados observados com o tratamento L sugerem a ocorrência derápido declínio de pH, seguido de reversão do processo fermentativo, pela falta de substrato disponível,para atingir a estabilização da fermentação, comoobservado por UMANÃ et al. (1991). 

O emurchecimento da alfafa melhorou a qualidade bromatológica e fermentativa da silagem.O aditivo LE (lactobacilos mais enzimas) melhorou a qualidade bromatológica das silagens frescas eemurchecidas, diminuindo em ambas o teor de FDN.O uso do aditivo E melhorou a qualidadefermentativa das silagens frescas, diminuindo a proporção de N-NH3.O uso de aditivos não melhorou a qualidadefermentativa nas silagens emurchecidas, com rela-ção às variáveis estudadas. 

ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALITICAL CHEMISTS -AOAC. 1995. Official methods of analysis. 16.ed. Washington: AOAC. 2000p.BARNES, D.K., GOPLEN, B.P., BAYLOR, J.E. 1988. Highlightsin the United States and Canada. In: ALFALFA and alfalfaimprovementt. Madison, American Society of Agronomy.p.1-24.BOTREL, M. de, A., ALVIM, M. J. Avaliações preliminares dealfafa, na região da Zona da Mata de Minas Gerais. In:WORKSHOP SOBRE O POTENCIAL FORRAGEIRO DEALFAFA (Medicago sativa L.) NOS TRÓPICOS, 1994,Juiz de Fora. Anais ... Juiz de Fora: EMBRAPA-CNPGL,1994. p.37-45.BÖTTCHER, W. 1982. Gas-chromatographische Analytik vonMilchsäure und fluchtigen Fettsäuren und Alkoholen inWassriger Lösung. Archiv für Tierernährung, 32(4):287-304.DUBOIS, M., GILLES, M., HAMILTON, J.K. et al. 1956.Colorimetric method for determination of sugars and relatedsubstances. Analytical Chemistry, 28(3):350-356.GARCIA, A. D., OLSON, W. G., OTTERBY, D. E. et al. 1989.Effects of temperature, moisture, and aeration on fermentationof alfalfa silage. J. Dairy Sci., 72(1):137-143.GOERING, H.K., VAN SOEST, P.J. 1970. Forage fiber analyses:apparatus, reagents, procedures and some applications.Washington: USDA, ARS (Agriculture Handbook, 379).HRISTOV, A.N. 1993. Effect of a commercial enzymepreparation on silage fermentation and protein degradability.Anim. Feed Sci. and Techn., 34:273-282.JONES, B.A., SATTER, L.D., MUCK, R.E. 1992. Influence ofbacterial inoculant and substrate addition to lucerne ensiledat different dry matter contents. Grass and Forage Sci.,47:19-27.KRISHNAMOORTHY, U., MUSCATO, T.V., SNIFFEN, C.J.et al. 1982. Nitrogenous fractions in feedstuffs. J. Dairy Sci.,65(2):217-225.KUNG JR, L., GRIEVE, D.B., THOMAS, J.W. et al. 1984.Added ammonia or microbial inocula for fermentation andcompounds of alfalfa ensiled at various percents dry matter.J. Dairy Sci., 67(2):299-306.KUNG JR., L., SATTER, L.D., JONES, B.A. et al. 1987.Microbial inoculation of low moisture alfalfa silage. J. DairySci., 70(10):2069-2077.MELVIN, J.F. 1965. Variations in the carbohydrate content oflucerne and the effect on ensilage. Austr. J. Agric. Res.,16:951-959.MUCK, R.E. 1987. Dry matter level effect on alfalfa silagequality. I. Nitrogen transformations.  Transactions of theASAE, 30:7-14.MUCK, R.E., WALGENBACH, R. 1985. Variation in alfafabuffering capacity. American Society of AgriculturalEngineers-Paper Nº 85-1535. American Society of AgriculturalEngineers, St. Joseph, MI. USA.PLAYNE, M.J.C., McDONALD, P. 1966. The bufferingconstituents of herbage and of silage. J. Sci. Food Agric.,17:262-268.PICHARD, G., RYBERT, G. 1993. Degradacion de las proteinasen el processo de ensilaje. Ciencia e Investigación Agraria,20(2):402-429.PITT, R.E. 1990. A model of cellulase and amylase aditives insilage. J. Dairy Sci., 73(7):1788-1799.PITT, R.E., MUCK, R.E., LEIBENSPERGER, R.Y. 1985. Aquantitative model of the ensilage process in lactate silage.Grass and Forage Sci., 40(3):279-303.SHEPERD, A.C., MASLANKA, M., QUINN, D. et al. 1995.Additives containing bacteria and enzymes for alfalfa silage.J. Dairy Sci., 78(3):565-572.STOKES, M.R. 1992. Effects of an enzyme mixture, an inoculant,and their interaction on silage fermentation and dairyproduction. J. Dairy Sci., 75:764-773.VALINOTTI, P., PICHARD, D. 1993. Efecto de la inoculacionbacteriana sobre la fermentacion del ensilage de alfafa frescasuplementada con carbohidratos solubles.  Ciencia eInvestigación Agraria, Santiago do Chile, 2:38. Abstract.VOIGT, J., STEGER, H. 1976. Zur Quantitativen Bestimungvon Amnoniak, Harnstoff und Ketokoerpernim biologischenMaterial. Archiv für Tierernaehrung, 17(4-5):289-293.WHITE, J.S., BOLSEN, K.K., HART, R.A. 1990. Effect ofinoculant and enzyme additives on preservation and nutritivevalue of alfafa silage. J. Anim. Sci., 68:579.WOOLFORD, M.K. 1984. The silage fermentation. New York,Marcel Dekker. p.23-132.ZONTA, E.P., ALMEIDA, A. Sistema de análise estatísticapara microcomputadores. Pelotas: SANEST, 1985.YU, Y., THOMAS, J.W. 1976. Estimation of the extent of heatdamage in alfalfa haylage by laboratory measurement.  J.Anim. Sci., 42:766-774.