Prevalência de Corynebacterium sp. no leite de vacas, sua relação com o manejo de ordenha e California Mastitis Test

A mastite bovina é a enfermidade que mais causa prejuízos na pecuária leiteira tendo como principal causa as bactérias, divididas em agentes ambientais e contagiosos.

As bactérias causadoras de mastite contagiosa incluem Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Mycoplasma bovis, considerados como patógenos principais e Corynebacterium bovis, como patógeno secundário. Corynebacterium bovis é a espécie, dentre os Corynebacterium sp., mais frequentemente isolada de glândulas mamárias e apesar de ser classificada como um patógeno secundário, seu papel na infecção intramamária ainda não está definido.

Autores relataram uma diminuição na produção de leite em mastites causadas por C. bovis [8]. Este agente foi frequentemente isolado de amostras de leite quando o pós-dipping não era praticado corretamente [2]. Estudos verificaram um aumento significativo na contagem de células somáticas (CCS) em amostras de leite com isolamento de C. bovis [7,11]. No entanto, autores descreveram que, apesar de C. bovis ser um dos agentes mais comumente isolados de amostras de leite, a CCS de quartos mamários individuais destas amostras é baixa, na maioria das vezes. [5,10]

Os objetivos do estudo foram determinar a prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos de cinco Estados e relacionar a presença deste agente com as práticas de ordenha nas propriedades. Além disso, avaliar a influência de Corynebacterium sp. no California Mastitis Test (CMT) de cada vaca dos rebanhos leiteiros no Estado de SC.

 

O estudo foi parte do Projeto CDA-RAM - Centro Colaborador em Defesa Agropecuária para monitoramento e avaliação do risco da resistência antimicrobiana em bactérias patogênicas para o gado de leite, tendo como responsável a Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora, MG. O projeto foi conduzido em cinco estados: PE, MG, PR, SC e RS.

O presente estudo foi realizado em duas etapas: Prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos dos cinco Estados e análise do questionário, avaliando os fatores de risco associados à presença de Corynebacterium sp. nas amostras de leite; Influência de Corynebacterium sp. no CMT individual das vacas de rebanhos leiteiros no Estado de SC.

Os rebanhos foram selecionados a partir da base de dados da Assistência Técnica dos rebanhos de seu Estado, e foram amostrados durante quatro vezes no período de janeiro de 2010 a julho de 2011, em intervalos semestrais.

A amostragem foi realizada de acordo com o número de animais em lactação por rebanho. Em rebanhos com até 30 animais em lactação, foram coletadas amostras de todas as vacas em lactação, e em rebanhos com mais de 30 animais em lactação, o número de animais amostrados foi no mínimo 30, selecionados de forma aleatória.

Os procedimentos de coleta e transporte das amostras de leite e o isolamento e identificação dos agentes da mastite seguiram as recomendações de National Mastitis Council [8].

Foram coletadas amostras de leite de cada vaca, dos rebanhos no Estado de SC, compostas pela mistura dos quatro quartos mamários. As amostras foram obtidas após a lavagem dos tetos com água, retirada dos primeiros jatos e após cuidadosa antissepsia da extremidade dos tetos com álcool 70%. A coleta foi realizada diretamente em frascos estéreis e o material amostrado foi imediatamente acondicionado em caixas isotérmicas, posteriormente congelado e encaminhado ao laboratório de bacteriologia, do Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal (CAV/UDESC), em Lages, SC, para isolamento bacteriano. Foi aplicado um questionário aos proprietários dos rebanhos de SC para obter informações sobre o manejo e cuidados higiênicos durante a ordenha, para controle e prevenção de mastites (exame dos primeiros jatos, lavagem e secagem dos tetos antes da ordenha, desinfecção pré e pós-ordenha, tratamento dos casos clínicos e tratamento de vaca seca). Os resultados do isolamento e identificação bacteriana, e os dados do questionário dos rebanhos nos Estados de MG, PE, RS e PR foram enviados ao CAV/UDESC, em Lages, SC.

Somente nos rebanhos do Estado de SC foi realizado o California Mastitis Test (CMT) dos animais amostrados. O resultado foi avaliado em função do grau de viscosidade da mistura de partes iguais de leite e reagente. Os resultados do CMT foram expressos em cinco escores classificados em: negativo, traços, +, ++ e +++ [9].

O isolamento bacteriano foi realizado através da semeadura de uma alíquota de 10 μL de leite de cada amostra, com alça descartável calibrada, em placas de Ágar sangue de carneiro a 5%. Após a inoculação das amostras de leite, as placas foram incubadas em estufa a 37°C por 24 a 48 h. As amostras que apresentaram isolamento bacteriano foram transferidas para um subcultivo em Ágar Triptona de Soja (TSA) ou Ágar Brain Heart Infusion (BHI) sendo incubadas durante um período mínimo de 18 h, para obtenção de culturas puras. Foram realizados os esfregaços corados pelo método de Gram, para verificação da morfologia e coloração da bactéria. Em seguida, os microrganismos foram identificados seguindo as recomendações do National Mastitis Council.

Foi classificado como Corynebacterium sp., o microrganismo que apresentou morfologia de colônias pequenas, brancas, secas, não hemolíticas, agrupadas na porção onde a gordura do leite estava concentrada devido seu caráter lipofílico, ou seja, sua exigência por ácidos graxos insaturados como o ácido oléico. Seu crescimento foi ausente ou escasso em 24 h de incubação, mas suas colônias se tornaram evidentes após 48 h de incubação. Nos esfregaços corados, o microrganismo apresentou formato de bastonetes Gram-positivos e no teste da catalase, observou-se a formação de bolhas indicando reação positiva. Apesar dos isolados de Corynebacterium sp. não apresentarem uma confirmação de C. bovis, pois não foram realizados os testes bioquímicos, os isolados foram sugestivos de C. bovis, devido seu caráter lipofílico e sua maior freqüência de isolamento na infecção intramamária.

Na primeira etapa, a análise dos dados foi realizada considerando os dados de campo, pela aplicação do questionário e os resultados das análises microbiológicas, que determinaram a prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de cada Estado. Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando o procedimento GML (General Linear Models) do SAS, para investigar quais os fatores de risco potenciais para a ocorrência de infecção intramamária causada por Corynebacterium sp.

Na segunda etapa, verificou-se a influência de Corynebacterium sp. no CMT individual dos animais de rebanhos de SC, através do teste de qui-quadrado (χ²) do pacote estatístico SAS.

 

Do total de 4949 amostras de leite individual dos animais, procedentes de rebanhos leiteiros de cinco Estados brasileiros, submetidas à cultura microbiológica, 666 (13,46%) amostras apresentaram isolamento de Corynebacterium sp. Os resultados das prevalências de Corynebacterium sp. nos Estados encontram-se na Tabela 1.

A prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos do Estado de MG foi significativamente diferente em relação às prevalências nos rebanhos dos Estados do Sul do Brasil, com um percentual de isolamento de 21,07%.

Considerando o total de rebanhos amostrados em cada Estado, Corynebacterium sp. foi isolado em todos os rebanhos nos Estados de MG e PE e nos demais, o número de rebanhos com isolamento deste agente também foi elevado.

Verificou-se uma frequência expressiva de isolamento de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros, quando comparado aos demais agentes contagiosos isolados (Staphylococcus sp. coagulase positiva, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae), os quais são considerados como os principais patógenos causadores de mastite.

Em relação ao manejo e cuidados higiênicos para controle e prevenção de mastite, os dados mostraram que mais de 80,0% dos rebanhos nos Estados de SC e RS realizavam o teste da caneca telada, porém 78,26% dos rebanhos no PR não realizavam este procedimento. A lavagem dos tetos era realizada com uma freqüência elevada nos rebanhos dos Estados da região Sul, mas nos rebanhos dos Estados de MG e PE, um percentual próximo a 30,0% não realizavam essa prática e foram nestes Estados que se encontraram as maiores prevalências de Corynebacterium sp. O pós-dipping não era praticado em 45,46% dos rebanhos no Estado de MG, contudo 65,22% dos rebanhos no PR não realizavam esta prática.

Os fatores de risco estudados, obtidos através da aplicação do questionário, não apresentaram influência significativa no isolamento de Corynebacterium sp. nas amostras de leite dos rebanhos (Tabela 2).

Apesar de 65,22% dos rebanhos do PR não realizarem o pós-dipping, a prevalência de Corynebacterium sp. foi baixa (9,63%), comparada aos rebanhos de MG e PE.

As amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC, que apresentaram isolamento de Corynebacterium sp., sofreram variações no número de quartos mamários positivos ao CMT. Estes resultados estão dispostos na Tabela 3.

Um maior percentual de amostras com isolamento de Corynebacterium sp. apresentou todos os quartos negativos ao CMT. No entanto, houve amostras que apresentaram reação positiva ao teste, mostrando que a presença de Corynebacterium sp. nas amostras de leite pode afetar o número de quartos mamários positivos, assim como nas amostras com isolamento dos demais patógenos contagiosos.

As amostras com isolamento de Corynebacterium sp. também mostraram variações quanto ao escore no CMT, sendo que o maior percentual (36,08%) destas apresentaram uma reação inflamatória mais intensa (escore 3). Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

As amostras com isolamento dos mais importantes patógenos da mastite (Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae), mostraram um maior percentual de amostras com escore 3 ao CMT, quando comparado com amostras que apresentaram isolamento de Corynebacterium sp.

Tabela 1. Prevalências de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de cinco Estados brasileiros durante o período de 2010 - 2011.

Tabela 2. Análise dos fatores de risco extraídos do questionário, associando-os com o isolamento de Corynebacterium sp. nas amostras de leite, oriundas de rebanhos leiteiros dos cinco Estados brasileiros durante o período de 2010 - 2011.

Tabela 3. Número de quartos mamários positivos ao CMT em função da presença ou ausência de isolamento e tipo de agente isolado nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC durante o período de 2010-2011.

Tabela 4. Escore no CMT em função da presença ou ausência de isolamento e tipo de agente isolado nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC durante o período de 2010-2011.

 

Corynebacterium sp. apresentou uma importante frequência de isolamento nas amostras de leite de rebanhos dos cinco Estados, semelhante ao encontrado em estudos anteriores que relataram uma presença crescente de Corynebacterium sp. nas amostras de leite submetidas a análise microbiológica [6,10]. No entanto, o fato de Corynebacterium sp. ser considerado um patógeno secundário não está relacionado apenas à frequência de isolamento mas também à sua capacidade de provocar mastite persistente e de significância limitada na produção e qualidade do leite.

O estudo mostrou que mesmo em propriedades onde era realizado o pós-dipping, Corynebacterium sp. foi isolado nas amostras de leite, concordando com os estudos anteriores que dizem que a desinfecção dos tetos pode ser influenciada pelo tipo de anti-séptico, presença de matéria orgânica, falta de reposição do produto e tipo de aplicador utilizado [6].

Já foi demonstrada grandes variações na CCS e no percentual de quartos mamários positivos ao CMT em função dos agentes isolados, concordando com os resultados do presente estudo [1]. O número de amostras de leite com infecção mista foi baixa e por isso foram excluídas da análise.

O percentual de amostras sem isolamento bacteriano e que apresentaram quartos positivos ao CMT pode ter ocorrido em conseqüência de fatores individuais do animal, como idade e ordem de parto, entre outros [3]. Além disso, a utilização de terapia antimicrobiana intramamária e a possibilidade da presença de outros agentes causadores de mastite como vírus ou micoplasmas, podem ter influenciado no número de quartos positivos nestas amostras.

A maioria das amostras com isolamento de Corynebacterium sp. apresentou reação mais intensa no CMT (escore 3) não condizendo com estudos anteriores que mencionaram o fato que, quando Corynebacterium sp. é isolado de amostras de leite, a CCS dos quartos mamários individuais destas amostras é baixa [5,10].

A presença de Corynebacterium sp. causou uma resposta celular, mesmo que de caráter moderado, em relação às amostras sem isolamento bacteriano. Esta reação inflamatória pode afetar de maneira significativa a CCS individual dos animais e conseqüentemente elevar a CCS do rebanho, assim como ocorre quando os principais patógenos, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, são isolados de amostras de leite.

 

A prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de SC, PR, RS, MG e PE foi de 13,46%, sendo que os rebanhos de MG apresentaram uma prevalência significativamente maior em relação aos demais Estados do Sul. O isolamento de Corynebacterium sp. não apresentou relação com as práticas de manejo avaliadas. O isolamento de Corynebacterium sp. nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC acarretou variações no CMT individual das vacas, não apenas no número de quartos positivos, mas também no escore do CMT.

Acknowledgments. Ao CNPq, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, ao Centro de Ciências Agroveterinárias (UDESC) e aos pesquisadores que forneceram os dados das amostras, obrigada pelo apoio.

Ethical approval. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA), do Centro de Ciências Agroveterinárias (UDESC) em Lages-SC, reunido no dia 29/10/2009, protocolado sob o número 1.34.09.

Declaration of interest. The authors report no confl icts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.

 

1 Brito M.A.V.P., Brito J.R.F., Ribeiro M.T. & Veiga V.M.O. 1999. Padrão de infecção intramamária em rebanhos leiteiros: exame de todos os quartos mamários das vacas em lactação. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 51(2): 129-135.

2 Haltia L., Honkanen-Buzalski T., Spiridonova L., Olkonen A. & Myllys V. 2006. A study of bovine mastitis, milking procedures and management practices on 25 Estonian dairy herds. Acta Veterinaria Scandinavica. 48 (1): 22.

3 Harmon R.J., Eberhart R.J., Jasper D.E., Langlois B.E. & Wilson R.A. 1994. Microbiological procedures for diagnosis of bovine udder infection. Arlington: National Mastitis Council, 34p.

4 Hogan J.S., Smith K.L., Todhunter D.A. & Schoenberger P.S. 1988. Rate of environmental mastitis in quarter infected with Corynebacterium bovis and Staphylococcus Species. Journal of Dairy Science. 71(9): 2520-2525.

5 Makovec J.A. & Ruegg P.L. 2003. Results of milk samples submitted for microbiological examination in Wisconsin from 1994 to 2001. Journal Dairy of Science. 86(11): 3466-3472.

6 Martins R.P. Silva J.A.G., Nakazato L., Dutra V. & Almeida Filho E.S. 2010. Prevalência e etiologia infecciosa da mastite bovina na microrregião de Cuiabá, MT. Ciência Animal Brasileira. 11(1): 181-187.

7 Mettifogo E., Muller E.E., Freitas J.C., Megid J., Alfi eri A.A. & Beloti V. 1991. Mastite subclínica bovina por Corynebacterium bovis no norte do Paraná, Brasil. Semina: Ciências Agrárias. 12(1): 41-44.

8 National Matitis Council. 2004. Microbiological procedures for the diagnosis of bovine udder infection and determination of milk quality. 4th edn. Verona: NMC, 47p.

9 Philpot W.N. & Nickerson S.C. 1991. Mastitis: counter attack. Naperville: Babson Bros, 150p.

10 Pitkala A., Haveri M., Pyorala S., Myllys V. & Honkanen-Buzalski T. 2004. Bovine mastitis in Finland 2001: prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance. Journal of Dairy Science. 87(8): 2433-2441.

11 Victoria C., Da Silva A.V., Elias A.O. & Langoni H. 2005. Corynebacterium bovis e os padrões de contagem de células somáticas no Brasil. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia. 8(2): 161-164.