Estudo cinético das enzimas hidrolases quimosina e lactase em leite bovino

1 INTRODUÇÃO

Sendo um dos mais notáveis grupos de macromoléculas existentes em sistemas biológicos, o estudo e caracterização de enzimas, assim como seu mecanismo de catálise, norteia a maior parte dos esforços dos bioquímicos e profissionais correlatos à área ao longo dos séculos (NELSON; COX, 2014). O aproveitamento das propriedades das enzimas dentro das indústrias já é de conhecimento do ser humano há tempos. A enzimologia industrial representa hoje um campo sólido e expressivo dentro da biotecnologia. A pesquisa, desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas direcionadas a aplicação de enzimas cresce exponencialmente a cada ano devido às vantagens significativas obtidas durante sua utilização, como altos índices de conversão, não geração de resíduos, por se tratarem de uma tecnologia limpa, especificidade e seletividade superiores quando comparados com catalisadores inorgânicos (WANDERLEY; NEVES; ANDRADE, 2011).

Nos dias atuais, o campo de aplicação de enzimas é extenso, abrangendo áreas diversas como a farmacologia, alimentícia e química propriamente dita. Baratto et al. (2011) destaca a intensa pesquisa biotecnológica sobre as enzimas hidrolíticas, sendo que estas apresentam um grande potencial de utilização no setor industrial. Ramos et al. (2011) enfatiza que a produção de biodiesel via enzimática é uma rota tecnológica cada vez mais explorada para a síntese desse biocombustível, uma vez que as lipases utilizadas para a hidrólise de triglicerídeos conferem ao processo todas as vantagens características de processos enzimáticos, como a regiosseletividade e a especificidade, reduzindo o número de subprodutos formados e a necessidade de tratamento de resíduos. Zanchetta (2013) aborda que a degradação da celulose em sacarídeos mais simples é aproveitada na indústria têxtil, conferindo um aspecto melhor aos tecidos. O mesmo ocorre com a produção de detergentes e saneantes, na qual são aplicadas proteases, amilases e lipases para melhor remoção de partículas de sujeira (DELATORRE et al., 2010).

Na indústria de alimentos seu uso atinge o ápice, sendo sua utilização visualizada em processos fermentativos, coagulantes e hidrolíticos. Um exemplo de aplicação é a indústria de laticínios, na qual além da coagulação do leite, proteases e lipases produzidas por microrganismos conferem textura e sabor aos derivados lácteos, principalmente durante a maturação desses produtos (ORLANDELLI et al., 2012).

A compreensão do mecanismo de atuação de uma enzima se dá principalmente através do estudo da cinética enzimática, que permite a verificação de quantidades de produto formadas e sua respectiva velocidade de formação, a partir do consumo de substrato ou variação de alguma propriedade do meio reacional (PRATTO, 2015). O desenvolvimento de modelos que expressem de forma satisfatória o decorrer da reação e que possibilitem uma identificação e análise dos fatores que influenciam seu andamento é fundamental para a utilização de enzimas em escala industrial.

Diante do presente contexto, o objetivo da pesquisa é o estudo da cinética enzimática da reação de coagulação de caseína no processo de fabricação de derivados lácteos, utilizando a enzima Quimosina, a diferentes concentrações, quantificando os resultados obtidos a partir do Método Fotocolorimétrico de Biureto. De forma semelhante, irá se proceder a quantificação da hidrólise da Lactose em leite pasteurizado pela enzima Lactase, a diferentes concentrações, a partir da variação de crioscopia das amostras do leite ao longo da reação, bem como propor, em cada ensaio cinético, um modelo matemático que descreva a atividade enzimática e a formação de produtos durante o andamento da reação para cada concentração de enzima utilizada.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização de ambos experimentos cinéticos, utilizou-se como substrato uma amostra de leite bovino pasteurizado comercializado pela empresa Laticínios Tirol.

2.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

A caracterização da amostra foi realizada através dos seguintes parâmetros físicoquímicos: crioscopia, acidez, teor de lipídeos e pH. A avaliação da crioscopia foi realizada em um crioscópio eletrônico digital da marca ITR modelo MK 54011. A verificação de pH foi feita utilizando-se um peagâmetro digital da marca Digimed. A acidez foi determinada através do método Dornic e o teor de lipídeos a partir do método Gerber.

2.2 QUANTIFICAÇÃO DE CASEÍNA

O processo de coagulação do leite ocorre a partir da interação da enzima Quimosina com as micelas de caseína. A Quimosina (EC 3.4.23.4) é classificada como uma protease. Antigamente era obtida a partir do estômago de ruminantes. Hoje, a Quimosina comercial é produzida a partir de fungos e leveduras (FERNANDES, 2015). Ao ser inoculada no leite, a Quimosina promove a clivagem das ligações peptídicas da camada superficial da micela de caseína, chamada ĸ – caseína, fazendo com que a caseína reaja com os íons Ca2+ do leite, levando à formação do Paracaseinato de Cálcio, produto de baixa solubilidade que se precipita, formando a coalhada (BRASIL et al., 2015). O experimento foi realizado com Quimosina microbiana destinada à coagulação, da marca Chy – Max ®, com poder coagulante de 950 IMCU.mL-1 , comercializado pela empresa Chr Hansen.

Para a quantificação da caseína utilizou-se o Método Fotocolorimétrico de Biureto, que é baseado na reação do Sulfato de Cobre em meio alcalino (reativo do Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). As ligações peptídicas das proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das proteínas no meio (OLIVEIRA, 2012).

O procedimento consiste em determinar a quantidade de proteínas precipitadas obtidas após a inoculação da enzima na amostra pela equação da reta obtida na curva padrão. Determina-se então a concentração (x = mg.mL-1 ) substituindo o valor da absorbância em y. A construção da curva padrão se dá pela plotagem da absorbância (y) a 540 nm pela concentração (x), para isso, determina-se a absorbância da amostra em cinco diferentes concentrações (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0) e do branco. A reação consiste na adição do reativo de Biureto na proporção 1:5 (diluição: Biureto). Após 30 minutos de reação, as absorbâncias foram determinadas a 540 nm em espectrofotômetro UV-Visível Pharo 300 da marca Merck.

2.2.1 Ensaio Cinético da Quimosina

Os experimentos para a obtenção dos modelos cinéticos da Quimosina foram conduzidos em temperatura de 38 ºC, temperatura ótima da enzima. Após a estabilização da temperatura, adicionou-se a enzima em diferentes concentrações (3,25; 7,5; 15 µL.L1 ) a serem testadas. Alíquotas foram retiradas em intervalos de 5 minutos e a quantificação das proteínas precipitadas por atuação da Quimosina foram determinadas pelo Método de Biureto. Os procedimentos foram realizados em triplicata e os dados obtidos foram tratados pela aplicação do método de regressão não-linear entre os dados experimentais, obtendo-se três modelos cinéticos que permitiram verificar a influência da concentração de enzima em cada ensaio cinético.

2.3 ESTUDO CINÉTICO DA LACTASE

O estudo cinético foi conduzido utilizando-se a enzima β – galactosidase (EC 3.2), comercializada pela empresa Prozyn. Conhecida como Lactase, é a enzima responsável pela hidrólise da Lactose presente no leite em dois sacarídeos mais simples, a Glicose e a Galactose. Produzida pelas mucosas do intestino, está intimamente associada a problemas de intolerância à Lactose, apresentados por indivíduos que possuem uma deficiência na síntese dessa enzima. Atualmente, existe uma crescente implantação no mercado de produtos zero lactose, nos quais a Lactase é adicionada durante o processo de fabricação, permitindo que estes indivíduos possam consumir derivados lácteos (PEREIRA et al., 2012).

A realização do estudo cinético da Lactase baseia-se no procedimento adotado por Czarnobay et al. (2017), que relaciona o aumento do índice crioscópico do leite com o grau de avanço da reação de hidrólise da Lactose. O procedimento está intimamente relacionado com o conceito de propriedades coligativas. Conforme Lima (2014), essas propriedades dependem da concentração de partículas do soluto, e não de sua natureza. Considerando o leite como uma solução que contém vários componentes dissolvidos (lipídeos, proteínas, sacarídeos, sais minerais, entre outros), observa-se um aumento crescente no índice crioscópico durante o transcorrer da hidrólise da Lactose presente no leite, o que é justificado devido ao fato de que, ao se hidrolisar, a Lactose gera duas moléculas (Glicose e Galactose), aumentando o número de partículas do soluto. Esse maior número de partículas gerado, por sua vez, interage mais fortemente com o meio, sendo necessário uma temperatura menor para que ocorra o congelamento. Deste modo, a verificação do aumento no índice crioscópico é uma forma de avaliar a cinética da Lactase, a partir da variação de uma propriedade do meio reacional.

Os experimentos foram conduzidos a 38 ºC. Concentrações de 0,075, 0,125 e 0,25 mL.L-1 foram avaliadas. Dez minutos após a inoculação da enzima, alíquotas foram retiradas do meio reacional para a determinação do valor da crioscopia, utilizando um crioscópio eletrônico digital da marca ITR modelo MK 54011. O valor foi expresso através de graus Hortvet (ºH). O procedimento foi realizado em triplicata. Os dados experimentais foram tratados e pela aplicação do método de regressão não-linear obtevese três modelos cinéticos que permitiram verificar a influência da concentração de enzima na cinética da Lactase. Utilizando a equação 1 fornecida por Prozyn (2018), calculou-se a porcentagem de hidrólise obtida durante o decorrer da reação e construiu-se o gráfico crioscopia versus porcentagem de hidrólise, que permitiu relacionar o andamento da reação com a evolução dos índices crioscópicos.

% Hidrólise = 350,877 x (Crioscopia Final – Crioscopia Inicial)

3 RESULTADOS

Os resultados das análises físico-químicas do leite comprovaram que este obedecia aos padrões estabelecidos pela Instrução Normativa Nº 62 (BRASIL, 2011) quanto a sua caracterização e composição. O leite em questão apresentou um teor de gordura de 3,0 %, acidez de 16,0 ºD, pH 6,5 e crioscopia inicial de – 0,545 ºH.

3.1 CINÉTICA DA QUIMOSINA

Os resultados obtidos para a formação do produto a partir da ação catalítica da Quimosina, nas três concentrações diferentes de enzima, são apresentados abaixo. Verificou-se que para todas as dosagens de enzima, a máxima velocidade de formação de produto (coágulo) ocorre majoritariamente em um período de até 25 minutos após sua inoculação.

Além disso, no período inicial de 0 a 10 minutos, tem-se as maiores velocidades de formação do produto. Tal fato pode ser explicado devido ao fato de que nesse período a concentração de substrato está em sua totalidade, ainda que, nesse caso, não se possa mensurá-la. A figura 1 apresenta a cinética enzimática da Quimosina a partir da quantificação do Paracaseinato de Cálcio formado, utilizando-se o método de Biureto. As três curvas distintas representam as três dosagens de enzima utilizadas em cada ensaio, mostrando a formação de produto a cada intervalo de tempo.

Estudo cinético das enzimas hidrolases quimosina e lactase em leite bovino - Image 1

A análise de variância (ANOVA) foi realizada para fins de validação da metodologia utilizada. A partir do método, o F calculado (14,44) foi maior que o valor tabelado (2,91), sendo que estes resultados validam o método proposto para quantificação do Paracaseinato de Cálcio obtido via enzimática (p< 0,05), a partir das diferentes concentrações de enzima, comprovando que estas produzem quantidades com uma variação significativa.

Aplicando-se o método de regressão não-linear nos dados coletados, obteve-se modelos cinéticos que relacionam a quantidade de produto formado com o tempo de reação para cada concentração de enzima testada. O modelo matemático que descreve a formação de produto para a dosagem de 3,25 µL é descrito pela equação 2, no qual a variável y representa a concentração de produto formado (mg.mL-1 ) e a variável t corresponde ao tempo de reação (min). O coeficiente de regressão não-linear (R2 ) obtido é de 0,9601, indicando que o modelo obtido descreve a formação de produto de uma maneira satisfatória (SAMPAIO, 2015).

y = 0,0345 ln(t) + 0,1373

Da mesma forma, obteve-se o modelo matemático, a partir de regressão nãolinear, para as dosagens de 7,5 e 15 µL, descritas pelas equações 3 e 4, respectivamente.

y = 0,0385 ln(t) + 0,1476

y = 0,0269 ln(t) + 0,2095

Os coeficientes de regressão não-linear (R2 ) para as equações 3 e 4 obtidos são, respectivamente, 0,9313 e 0,9875, novamente evidenciando boa correlação entre as variáveis. Novamente, a partir das equações obtidas, substituindo-se a variável t pelo tempo (min), é possível obter a concentração do produto formado (mg.mL-1 ). De forma semelhante, é possível substituir uma dada concentração e verificar o respectivo tempo para formação dessa quantidade, em cada uma das três equações geradas.

3.2 CINÉTICA DA LACTASE

Os dados de crioscopia obtidos para a amostra de leite após a inoculação da Lactase, utilizando as três dosagens de enzima, são apresentados na figura 2.

Estudo cinético das enzimas hidrolases quimosina e lactase em leite bovino - Image 2

De modo semelhante ao experimento anterior, aplicou-se a análise de variância (ANOVA), obtendo-se um valor de F (22,73) superior ao valor tabelado (2,84), validando a metodologia proposta de verificação da hidrólise enzimática da Lactose através do aumento do índice crioscópico, uma vez que a variação gerada entre resultados foi significativa para algumas das concentrações de enzima utilizadas (p< 0,05).

Calculou-se a porcentagem de hidrólise da Lactose obtida em cada intervalo de tempo aplicando-se a equação 1, relacionando a diferença entre o índice crioscópico aferido nesses períodos e o inicial, antes da inoculação da enzima, como demonstra a figura 3.

Estudo cinético das enzimas hidrolases quimosina e lactase em leite bovino - Image 3

De forma análoga ao experimento anterior, procurou-se correlacionar cada valor de crioscopia obtido com o respectivo intervalo de tempo utilizado, obtendo-se a equação de cada curva que descreve o aumento dos índices crioscópicos e consequente percentual de hidrólise obtido durante o decorrer da catálise enzimática, por meio da aplicação de regressão não-linear entre os dados experimentais, sendo possível avaliar a qualidade do modelo através do coeficiente de regressão gerado (SAMPAIO, 2015). O modelo matemático que descreve a curva para cada corrida experimental feita a partir da dosagem de 0,075 mL é apresentado na equação 5. Nesse modelo, a variável y representa o índice crioscópico obtido a cada intervalo de tempo t. O R2 gerado foi de 0,9646.

Y = 0,0556 ln(t) + 0,5238

Os modelos de curvas cinéticas obtidos para as dosagens de 0,125 mL e 0,25 mL são apresentados nas equações 6 e 7, respectivamente.

Y = 0,0564 ln(t) + 05577

y = 0,0588 ln(t) + 0,5606

Por sua vez, os coeficientes de regressão não-linear obtidos foram 0,9943 para a equação 6 e 0,9832 para a equação 7. De forma análoga ao experimento anterior, substituindo-se as variáveis t pelo tempo (min) e y pelo índice crioscópico (-ºH), é possível obter os respectivos valores de crioscopia ou o tempo necessário para que se atinja um determinado índice crioscópico.

Dessa forma, verifica-se que as equações obtidas se aplicam de forma adequada para representar a ação catalítica da Lactase. Os valores elevados obtidos para o coeficiente de regressão indicam que existe alta correlação entre as variáveis, sendo que os modelos gerados expressam de maneira satisfatória a evolução dos valores de crioscopia ao longo da hidrólise da Lactose.

4 DISCUSSÃO

O modelo cinético de Michaelis-Menten que relaciona as velocidades de formação de produtos com a variação do substrato à medida que este é consumido durante a reação é, certamente, o mais conhecido na área da cinética enzimática (MARTINS, 2015). Contudo, apresenta algumas limitações ao considerarmos que sua aplicação só é eficiente em sistemas homogêneos e que a proporção de reagentes e produtos seja mantida. Pratto (2015) observa tais limitações ao tentar se aplicar o modelo para quantificar a hidrólise enzimática da Celulose, uma vez que as enzimas encontram-se em fase aquosa e o substrato se apresenta em estado sólido.

Na maioria dos casos, faz-se necessário o desenvolvimento de um modelo próprio, no qual a catálise enzimática é quantificada pela medida da variação de alguma propriedade inerente ao meio reacional e não com a variação da concentração de um substrato propriamente dito. Uma vez que o procedimento apenas quantificava a formação do produto, o modelo de Michaelis-Menten não poderia ser aplicado por não se ter informações a respeito do consumo de substrato no decorrer da catálise. Apesar da metodologia diferente, conseguiu-se uma aproximação semelhante com estudos cinéticos que utilizaram o este modelo (GOMES, et. al., 2016).

Ao se observar o gráfico 1, percebe-se que para o tempo de 5 minutos, as dosagens de 3,25 e 7,5 µL produzem uma quantidade similar de produto formado, enquanto que para a concentração de 15 µL a quantidade é muito superior. Como era de se esperar, nota-se que a quantidade de enzima influencia na quantidade de produto formado e consequentemente sua velocidade de formação. Concentrações elevadas de enzima (15 µL) geram a mesma quantidade de produto (0,25 mg.mL-1 ) nos períodos iniciais de reação (5 minutos) que a dosagem de 7,5 µL só atinge após 25 minutos transcorridos da inoculação da enzima, embora após esse período quase todo substrato encontre-se convertido e a catálise ocorre a velocidades inferiores se comparada as demais concentrações.

A análise do ensaio cinético da Lactase a partir da figura 2 evidencia que a ação de hidrólise possui uma duração superior se comparada à Quimosina. Dessa forma, comparando-se a ação das duas enzimas, observa-se que a catálise continua acontecendo, em um grau significativo, após 30 minutos do início da reação, sendo que a diminuição da velocidade de formação de produtos e consequente estabilização da ação enzimática ocorre apenas após 60 minutos da inoculação da enzima, embora a hidrólise ainda continue a acontecer.

Nota-se uma diferença significativa na variação de crioscopia entre as corridas experimentais utilizando 0,075 e 0,125 mL de enzima, enquanto que essa variação não foi tão expressiva comparando-se os ensaios realizados com as dosagens de 0,125 e 0,25 mL. Esse resultado encontrado abre margem para a possibilidade de que concentrações superiores de enzima pouco alteram a velocidade e o percentual de hidrólise, sendo que a concentração de substrato pode exercer uma influência maior do que a concentração de enzima. Entretanto, não se pode afirmar com totalidade que apenas a concentração de substrato determina a cinética da Lactase, conforme demonstra a diferença das curvas geradas pelas concentrações de 0,075 e 0,125 mL.

Sabe-se que, nos instantes iniciais da catálise, todos os sítios ativos da enzima estão ligados às moléculas de substrato, não havendo formação de produtos em quantidade suficiente para causar uma possível inibição competitiva pelo sítio ativo da enzima, como acontece em muitos casos, devido à natureza similar do substrato e do produto (MARTINS, 2015). Verifica-se uma diminuição mais acentuada da velocidade de catálise a partir de 60 min transcorridos da inoculação da enzima. Além do consumo e consequente diminuição da quantidade de substrato, sabe-se que, no caso da hidrólise da Lactose, um dos produtos formados, a Galactose, compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima. Hortêncio et al. (2013) avalia os efeitos dessa inibição competitiva na hidrólise da Lactose, verificando que a presença do inibidor (Galactose) não altera o perfil cinético da Lactase. Todavia, é observado uma queda na velocidade de formação dos produtos, devido à presença do inibidor. Devido a essa inibição, existe a possibilidade da cinética enzimática se aproximar de um modelo de primeira ou segunda ordem (CZARNOBAY, et. al., 2017).

A figura 3 permite visualizar o aumento da porcentagem de hidrólise a cada intervalo de tempo. A porcentagem de hidrólise quase atinge sua totalidade para as concentrações maiores de enzima, embora os percentuais obtidos para estas dosagens não apresentem uma grande variação. Assim sendo, é possível a percepção de alguns aspectos já visualizados no gráfico anterior, como a pouca influência no aumento dos índices de hidrólise à medida que se aumenta a concentração de enzima e a diminuição na velocidade de formação de produtos após intervalos de tempo superiores a 60 minutos, devido ao consumo de substrato se aproximar de sua totalidade.

5 CONCLUSÃO

As metodologias empregadas nos experimentos se mostraram adequadas para a realização do estudo cinético de ambas as enzimas. Conseguiu-se, com sucesso, verificar a ação catalítica de cada enzima a partir da quantificação de produto formado e da mudança de uma propriedade inerente ao meio reacional, diferindo da maioria dos modelos existentes que expressam cinética enzimática a partir do consumo de substrato a cada intervalo de tempo. Os modelos cinéticos gerados, por sua vez, apresentam de maneira satisfatória a condução da catálise enzimática, expressando o transcorrer da reação de maneira adequada em cada ensaio cinético executado.

Observou-se que a melhor concentração para a cinética da Quimosina é de 15 µL, enquanto que para a Lactase a melhor concentração é de 0,25 mL, uma vez que ambas proporcionam uma formação de produto em menor tempo. Além disso, observou-se que a cinética de ambas enzimas é semelhante na maioria dos aspectos visualizados, verificando-se uma diferença na quantidade de produto formado e na velocidade de reação para dosagens menores de enzima, enquanto que essa diferença não é tão visível para dosagens superiores de enzima, apesar da formação máxima de produto ser mais rápida. Com isso, é possível notar que a concentração de enzima é uma condição importante que afeta a cinética enzimática até um determinado momento, a partir do qual a concentração de substrato passa a exercer maior influência, uma vez que seu consumo e consequente diminuição de quantidade passam a interferir de forma mais significativa na velocidade e formação de produtos.

Esse artigo foi originalmente publicado em Brazilian Journal of DevelopmentISSN: 2525-876119040Brazilian Journal of Development, Curitiba, v.7, n.2, p.19040-19053jan. 2021.DOI:10.34117/bjdv7n2-515 | https://www.brazilianjournals.com/index.php/BRJD/article/view/25197/20172. Este trabalho está licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 International License.

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Referências

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