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Perfis de resistência de Staphylococcus aureus isolados no leite de vacas com mastite subclínica

Publicado: 07/02/2013
Autor/s. : Luiz Francisco Zafalon do Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio de Bovinos de Leite, Instituto de Zootecnia, Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios - APTA -, SP; Antônio Nader Filho do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP -, SP, e José Victor de Oliveira e Flávio Dutra de Resende do Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico dos Agronegócios da Alta Mogiana, APTA, SP.
Sumário

RESUMO: Staphylococcus aureus é considerado o mais importante agente etiológico infeccioso da mastite bovina, havendo redução da produção de leite e possibilidade de perda de função dos quartos mamários acometidos. Efetuou-se o presente estudo visando verificar os perfis de resistência de S. aureus isolados de 66 quartos mamários com mastite bovina frente à ampicilina (10 μg), clindamicina (2 μg), eritromicina (15 μg), gentamicina (30 μg), oxacilina (1 μg), penicilina (10 UI), sulfazotrim (25 μg) e tetraciclina (30 μg). As estirpes foram classificadas em grupos da seguinte maneira: "A", resistentes à ampicilina e/ou à penicilina; "B", resistentes à ampicilina e/ou à penicilina e/ou à oxacilina; "C", resistentes à sulfadiazina mais trimetoprim; "D", sem resistência aos antimicrobianos testados. Dentre as 66 amostras testadas, 87,9% apresentaram resistência aos beta-lactâmicos e 40,9% foram resistentes à oxacilina. Dentre Staphylococcus aureus isolados em quartos mamários com mastite recidivante, quatro até então classificados como pertencentes ao grupo "A" passaram a ser classificados dentro do grupo "B", uma amostra que era agrupada como "A" passou a pertencer ao grupo "D", uma do grupo "B" passou para o grupo "A", enquanto três amostras continuaram a ser classificadas no mesmo grupo, sendo duas dentro do grupo "A" e uma no grupo "D". S. aureus demonstrou maior resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos, como a penicilina, ampicilina e oxacilina (77,3%, 68,2% e 40,9%, respectivamente), enquanto os maiores índices de sensibilidade foram encontrados para a gentamicina, sulfa mais trimetoprim, clindamicina e eritromicina (97,0%, 96,3%, 95,6% e 94,4% respectivamente).

Palavras-chave: antibióticos, leite, resistência, Staphylococcus aureus.

INTRODUÇÃO

Staphylococcus aureus constitui-se no principal agente infeccioso da mastite bovina, com grande repercussão econômica. A penetração do agente pelo canal do teto e a sua multiplicação na glândula levam à diminuição na produção de leite e, ocasionalmente, perda da função da glândula mamária (SCHALM et al., 1971).

Em alguns países, a incidência de mastite por S. aureus foi reduzida, sendo, no entanto, o microrganismo ainda mais comumente isolado. Um indicativo da habilidade do S. aureus de se adaptar a novas condições é o aumento da ocorrência de casos de mastite em novilhas que são causados por este microrganismo.

Por ser a mastite a enfermidade mais freqüente e dispendiosa do gado leiteiro, o prejuízo dela decorrente atinge cifras elevadas em conseqüência da redução na produção de leite e dos prejuízos na composição físico-química que podem inutilizar o produto para o consumo ou mesmo para o beneficiamento. Além disso, existem os gastos com medicamentos, com a desvalorização do animal e com a precária qualidade sanitária do leite (STEHLING et al., 1986).

O exame bacteriológico do leite, obtido a partir de um único quarto ou de amostras compostas é o procedimento padrão para se estabelecer se há infecção (ELVINGER e NATZKE, 1992). Nos casos de surtos de mastite clínica em um rebanho ou em casos isolados, especialmente em vacas de alto valor zootécnico, o isolamento do agente etiológico é o método diagnóstico de eleição. A cultura do leite de vacas do rebanho é útil no monitoramento da prevalência e dos agentes etiológicos presentes (SEARS et al., 1993).

Vários testes podem ser utilizados para a identificação de S. aureus, diferenciando-o de outros estafilococos. SILVA e GANDRA (2004) chamam a atenção para a análise de resultados em conjunto para a discriminação das espécies. Além disso, é necessário o conhecimento dos padrões de resistência antimicrobiana do microrganismo. Esta conduta é fundamental para o desenvolvimento de métodos preventivos que sejam efetivos, assim como para a construção de estratégias de tratamento quando forem necessárias (SABOUR et al., 2004).

Diante do exposto, objetivou-se verificar os perfis de resistência de S. aureus, isolados em quartos mamários de vacas com mastite, a antimicrobianos do grupo dos beta-lactâmicos, além de proceder-se ao acompanhamento destes quartos com o intuito de averiguar possíveis mudanças nos padrões encontrados.

 

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi conduzido em uma propriedade produtora de leite do tipo "C", localizada na região de Barretos, Estado de São Paulo, cuja produção de leite era de, aproximadamente, oito litros diários por animal. Foram acompanhados 66 quartos mamários de vacas com mastite em que houve o isolamento prévio de S. aureus, durante o período correspondente entre janeiro de 2001 e abril de 2002, com intervalos de cinco meses entre as visitas à propriedade.

As colheitas do leite foram realizadas utilizando- se tubos de ensaio esterilizados para os quartos mamários que apresentavam amostras de leite reagentes ao "California Mastitis Test" (CMT). As amostras foram transportadas para as análises laboratoriais após o acondicionamento em caixas de material isotérmico (isopor), contendo cubos de gelo. Ao chegar ao laboratório, 10 μL de leite de cada quarto mamário foram semeados sobre a superfície de placas de Petri em duplicatas, contendo ágar sangue ovino a 5%, em aerobiose. Após a incubação a 37oC durante 24 a 48 horas, as colônias foram investigadas quanto às características de crescimento, coloração, além de serem submetidas aos esfregaços corados pelo método de Gram (HARMON et al., 1990).

Os microrganismos sob a forma de cocos Grampositivos, foram submetidos às provas da catalase e da coagulase lenta com plasma de coelho (HOLMBERG, 1973). Submeteu-se as amostras catalase e coagulase positivas à prova para verificação da produção de acetoína e aquelas que produziram acetoína foram testadas quanto à utilização ou não da maltose e trealose para a diferenciação entre S. aureus e Staphylococcus schleiferi subespécie coagulans. As amostras que mostraram-se positivas a estas provas, foram, então, classificadas como S. aureus (HOLT et al., 1994).

Os microrganismos isolados foram submetidos aos testes de sensibilidade in vitro, utilizando a técnica de difusão com discos (BAUER et al., 1966) em placas de Petri contendo ágar Müeller-Hinton, em cuja superfície fora dispostos discos impregnados com os seguintes princípios ativos: ampicilina (10 μg), clindamicina (2 μg), eritromicina (15 μg), gentamicina (30 μg), oxacilina (1 μg), penicilina (10 UI), sulfazotrim (25 μg) e tetraciclina (30 μg). Decorridas 24 horas de incubação a 35°C, procedeu-se a aferição dos halos de inibição formados em torno dos respectivos princípios ativos, segundo o National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2005).

Após os testes de sensibilidade, as amostras foram agrupadas de acordo com os seus perfis de resistência, da seguinte maneira: grupo "A", resistentes à ampicilina e/ou à penicilina; grupo "B", resistentes à ampicilina e/ou à penicilina e/ou à oxacilina; grupo "C", resistentes à sulfadiazina mais trimetoprim; grupo "D", sem resistência aos antimicrobianos testados

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Considerada uma doença multifatorial de grande importância para a pecuária de leite, a mastite acarreta sérios prejuízos econômicos decorrentes, dentre outros fatores, da diminuição da produção láctea. Sob o ponto de vista econômico, a mastite é a mais importante doença do gado leiteiro, apresentando alta prevalência em todo o mundo. Além da forma clínica, a enfermidade apresenta-se, também, sob a forma subclínica, sendo esta mais prejudicial financeiramente com perdas econômicas devido à freqüência e persistência do processo (VIANNI e LÁZARO, 2003).

Regras práticas para a seleção e uso de antimicrobianos são preocupações há algum tempo, com ênfase na necessidade de doses adequadas de princípios ativos e por períodos limitados, além do monitoramento dos padrões de sensibilidade para que problemas de resistência possam ser evitados (SANFORD, 1976). O uso inadequado de antibióticos para o tratamento da mastite favorece a pressão seletiva em cepas multi-resistentes (VIANNI e LÁZARO, 2003).

Considera-se o teste de sensibilidade "in vitro" um importante fator no sucesso do tratamento da mastite. Entretanto, é comum o uso indiscriminado de medicamentos sem a realização do mesmo, sujeitando a glândula mamária a tratamentos inadequados que podem ocasionar agravamento do processo e desenvolvimento de resistência por parte dos microrganismos (COSTA et al., 1999).

No Quadro 1 constam os padrões de resistência encontrados nos microrganismos isolados dos quartos mamários.

Quadro 1. Classificação de S. aureus isolados de quartos mamários com mastite bovina, de acordo com a apresentação ou não de resistência aos grupos de antimicrobianos testados

SABOUR et al. (2004) avaliaram um total de 212 S. aureus isolados de casos de mastite bovina, 24,5% dos quais foram resistentes pelo menos a um antimicrobiano, com a resistência à penicilina sendo a mais comum. No mesmo estudo, foram encontradas variações nos padrões de resistência em diferentes regiões, enquanto os níveis de resistência aos antimicrobianos dos microrganismos isolados nas amostras de leite, antes e depois do tratamento, foram similares.

De oito antimicrobianos testados no presente estudo, 68,2% dos microrganismos apresentaram resistência a mais de um princípio ativo. O perfil de resistência mais encontrado foi contra os antimicrobianos beta-lactâmicos (87,9% das amostras).

Quadro 2. Perfis de sensibilidade de S. aureus isolados de casos de mastite bovina frente a diferentes antimicrobianos

Nota-se que o princípio ativo ao qual os microrganismos apresentaram maior sensibilidade foi a gentamicina (97%). Entre os princípios ativos de maior resistência por parte das estirpes de S. aureus, figuraram a penicilina G, a ampicilina e a oxacilina (77,3%, 68,2% e 40,9%, respectivamente).

A resistência à penicilina e à ampicilina por parte de estirpes de S. aureus isoladas no leite foi encontrada, também, por outros autores, como ARAÚ- JO (1998) (43,8% e 44,8%, respectivamente) e BRITO et al. (2001) (65% para ambos os princípios ativos). Porém, estes mesmos autores não detectaram a resistência à oxacilina.

YOSHIMURA et al. (2002) também relataram resistência a um ou mais antimicrobianos em 37,4% de S. aureus isolados e que o padrão de resistência à benzilpenicilina, dihidroestreptomicina e canamicina foi o mais freqüente. Estes mesmos autores não encontraram resistência à meticilina, lincomicina, clindamicina e florfenicol.

A seleção de bactérias resistentes pelo uso incorreto de antimastíticos, além das modificações biológicas introduzidas pelo próprio homem, podem explicar as diferenças encontradas na sensibilidade bacteriana (LANGONI et al., 1991), o que torna difícil a comparação de resultados entre diferentes estudos.

Microrganismos que exibem resistência às penicilinas resistentes à penicilinase são classificados como S. aureus meticilina (oxacilina)-resistentes ("MRSA"). Tais microrganismos são, também, freqüentemente resistentes à maioria dos agentes antimicrobianos, incluindo os aminoglicosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, tetraciclina e fluorquinolonas (MANDELL et al., 1995).

De forma geral, quando o agente causador da mastite é S. aureus, a resistência mais comum observada é à penicilina, um dos antibióticos mais utilizados em vacas leiteiras. Segundo SOL et al. (2002), quando estirpes de S. aureus são resistentes à meticilina, elas apresentam como característica principal a multi-resistência a todos os antibióticos do grupo dos beta lactâmicos, além da resistência a outros antimicrobianos.

Para LEE (2003), isolados "MRSA" devem ser considerados resistentes a todas as cefalosporinas e outros ß-lactâmicos (como ampicilina, amoxicilinaácido clavulônico, ticarcilina-ácido clavulônico e os carbapenos) devido aos resultados dos testes de sensibilidade "in vitro" obtidos com estes agentes. Existem evidências clínicas de que os isolados de S. aureus resistentes à oxacilina não respondem ao tratamento in vivo com cefalosporinas. Desta forma, mostram-se preocupantes os achados do presente estudo, já que houve razoável quantidade de isolados resistentes à oxacilina.

Vários trabalhos relatam a possibilidade de transmissão de S. aureus entre o homem e os bovinos. A infecção do homem pelo consumode produtos como o leite contaminado com linhagens "MRSA" de origem animal é aventada. Uma vez ocorrida a transferência interespécie, estes microrganismos podem tornar-se disseminados no meio animal.

Nas estirpes de S. aureus isoladas do leite dos animais estudados, 40,9% mostraram-se resistentes à oxacilina. A propriedade foi acompanhada a intervalos de cinco meses, em quatro visitas. Enquanto na primeira visita 21,05% dos isolados eram resistentes à oxacilina, nenhum apresentou resistência cinco meses depois. Decorridos outros cinco meses, todos eram resistentes, enquanto 66,7% dos isolados eram resistentes na última visita, após mais cinco meses. Entre nove quartos mamários com reinfecções que foram acompanhados, quatro apresentaram estirpes que passaram a apresentar resistência à oxacilina, sem tê-la apresentado anteriormente.

Segundo AMARAL et al. (1996), foi constatada múltipla resistência de estirpes de S. aureus que foram isoladas da água utilizada no processo de obtenção do leite em dez propriedades rurais localizadas na região de Jaboticabal, Estado de São Paulo. Os autores classificaram tais achados preocupantes pelo papel da água como veiculadora de agentes infecciosos da mastite bovina, além de todos S. aureus isolados apresentarem-se como resistentes à oxacilina.

Durante o período de estudo não foi relatada a utilização de beta-lactâmicos para o tratamento de casos de mastite. Entre os mesmos nove quartos mamários que se mostraram reinfectados, demonstrou- se que uma estirpe de S. aureus deixou de apresentar resistência à ampicilina, dentre aquelas que a apresentavam anteriormente. Dentre os quartos que apresentavam estirpes com resistência a um ou mais beta-lactâmicos (oito quartos), sete continuaram a apresentar resistência a esta classe de antimicrobianos.

 

CONCLUSÕES

O isolamento de estirpes de S. aureus resistentes à oxacilina nas amostras de leite dos animais com mastite bovina alerta para a possível elevação deste perfil de resistência na área veterinária, tornando necessários estudos que monitorem o perfil epidemiológico do microrganismo, o que traria condições não só para o controle e prevenção da mastite bovina, mas também maior segurança à saúde humana.

 

AGRADECIMENTO

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 98/16087-6).

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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