Suplementação de touros com sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados e qualidade seminal pré e pós-congelação
Publicado: 6 de maio de 2013
Por: Mónica Marcela Ramírez Hernández, Ricardo Macedo Gregory, Maria Inês Mascarenhas Jobim e Rodrigo Costa Mattos do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Rio Grande do Sul -UFRGS-, RS, e Harold Ospina Patino, Juan Camilo Angel e Diogo del Re do Programa de Pós-graduação em Zootecnia da Faculdade de Agronomia, UFRGS, RS.
Sumário
O objetivo deste experimento foi avaliar a qualidade seminal de touros suplementados com sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA). Vinte touros das raças Angus, Brangus, Hereford e Braford foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos, cada um com dez animais. Cada grupo recebeu uma dieta composta de volumoso, ração comercial, sal mineral e um de dois suplementos: funcional com a incorporação de sabões cálcicos de PUFA ou energético, com a incorporação de raspa de mandioca (Manihot esculenta, Crantz). Durante o período experimental, a qualidade seminal foi avaliada utilizando testes rotineiros (volume, concentração, motilidade em massa, motilidade individual e avaliação da morfologia espermática) e testes complementares (teste hiposmótico, coloração dupla giemsa/tripan-azul e teste de termorresistência). O sêmen in natura do grupo de touros suplementados com sabões cálcicos de PUFA comercial (Megalac-E®) apresentou aumento na motilidade espermática (83,3% vs. 75,3%), na percentagem de espermatozoides com acrossoma íntegro (94,8% vs. 91,8%) e na percentagem de espermatozoides viáveis (98,0% vs. 96,6%) quando comparado com o sêmen do grupo de touros suplementados com raspa de mandioca (P<0,05). O tipo de suplemento não afetou o volume seminal, a concentração espermática e concentração de testosterona em sangue (P>0,05). Foram encontradas interações entre tratamento e número de coleta para percentagem de espermatozoides morfologicamente normais e percentagem de espermatozoides positivos ao teste hipo-osmótico (P<0,05). Após a descongelação, o tipo de suplemento não afetou a motilidade dos espermatozoides, o teste hipo-osmótico e o teste de termoresistência rápido (P>0,05). A suplementação com sabões cálcicos de PUFA aumentou as percentagens de espermatozoides com acrossoma íntegro (48,0% vs. 39,2%) e de espermatozoides com membrana plasmática integra (51,5% v.s 42,2%) pós-descongelação.
Palavras-chave: Touros. Sabões cálcicos. Ácidos graxos poli-insaturados. Características seminais. Raspa de mandioca.
Introdução
As biotécnicas da reprodução assistida são ferramentas atuais cada vez mais utilizadas nos sistemas de produção de bovinos na busca de eficiência reprodutiva. Deste modo, torna-se cada vez mais importante o entendimento dos fatores que podem influenciar os resultados em tais sistemas, entre eles a qualidade do sêmen1.
A qualidade do sêmen afeta diretamente o desempenho reprodutivo do touro2,3, pois as características seminais exercem um efeito importante desde o momento que os espermatozoides entram no trato reprodutivo da fêmea até o momento da fecundação4. Estudos têm detectado variações na fertilidade a partir de diferentes características seminais5 e mais recentemente alguns autores têm encontrado relações entre a concentração espermática, percentual de espermatozoides morfologicamente normais e a motilidade3,6.
O nível energético tem sido abordado nos estudos da influência da nutrição sobre a produção, reprodução e qualidade seminal, sendo mais importante nos animais em desenvolvimento destinados a serem futuros reprodutores7,8. Atualmente os estudos da influência da nutrição sobre a fertilidade bovina têm focado nas estratégias nutricionais para aumentar a qualidade dos espermatozoides nos machos e resposta nos programas de sincronização e qualidade do embrião nas fêmeas9. A suplementação com ácidos graxos tem sido orientada ao incremento do aporte energético na dieta, com o objetivo de melhorar o balanço energético. Recentemente, além da energia proporcionada pelos ácidos graxos, busca-se os benefícios que eles possuem como alimento funcional10.
Estudos demonstram que a suplementação de machos com ácidos graxos poli-insaturados melhora a qualidade seminal e incrementa os precursores de hormônios necessários para os processos reprodutivos11,12. Em touros, os ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) podem melhorar a integridade e viabilidade da membrana espermática, além disso, Kelso et al.13 encontraram diminuição das concentrações de ácidos graxos poli-insaturados no plasma seminal com o envelhecimento dos indivíduos. Desta maneira, torna- -se muito importante avaliar os possíveis benefícios da suplementação com PUFA sobre a qualidade seminal em touros.
O objetivo do presente estudo foi avaliar as características do sêmen de touros suplementados com sabões cálcicos de PUFA, determinando o seu efeito sobre a qualidade seminal pré e pós-descongelação.
Material e Método
Local e duração do experimento
O experimento foi realizado na central de processamento e congelamento de sêmen PROGEN®, localizada no município de Dom Pedrito, RS, Brasil. O período experimental teve uma duração de 76 dias e foi iniciado com a pesagem, avaliação andrológica e início da suplementação dos animais. Foram realizadas cinco coletas de sêmen a cada quinze dias para avaliar a qualidade do sêmen in natura e, posteriormente, o sêmen foi congelado e avaliado pós-descongelação. As avaliações do sêmen in natura foram realizadas na PROGEN® enquanto as avaliações pós-descongelação foram realizadas no Laboratório de Reprodução Animal (REPROLAB) do Departamento de Medicina Animal da UFRGS.
Tratamentos
Avaliou-se o efeito de dois tipos de suplementos energéticos fornecidos para touros alimentados individualmente com volumosos cortados (pastagem de aveia ou cultivadas), ração comercial e sal mineral. Os tratamentos avaliados foram os seguintes:
Suplemento funcional: 200 g/d de sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados (Megalac-E®). (Fornecida por QGN Química Geral do Nordeste, Brasil) eSuplemento energético: 745 g/d de raspa de Mandioca (Manihot esculenta, Crantz).
As dietas foram isoenergéticas (Tabela 1); a composição dos ingredientes das dietas está apresentada na tabela 2; enquanto, a razão entre a quantidade administrada de cada ingrediente dietário e o peso vivo dos animais está na tabela 3.
Animais e Manejo
Foram utilizados vinte touros das raças Angus, Brangus, Hereford e Braford, com peso médio de 950 kg e idade entre 4 e 10 anos. Cada animal foi considerado uma unidade experimental e alocado em um dos tratamentos mediante um processo de aleatorização estratificada, de modo a existirem animais de diferentes raças e idades similares dentro dos tratamentos.
Os touros estiveram alocados em vinte piquetes individuais de um hectare cada, divididos com cerca elétrica, cochos e bebedouros individuais. Os animais receberam volumoso verde cortado duas vezes ao dia e suplementação (fontes energéticas, ração comercial e sal) uma vez ao dia.
Coletas de sêmen
Foram realizadas cinco coletas de sêmen, sendo que a primeira foi feita ao início do experimento e tomada como referência pré-experimental. Posteriormente, os animais foram adaptados às dietas experimentais durante 15 dias. Após este período de adaptação, foram realizadas quatro coletas de sêmen com intervalo aproximado de 15 dias. O sêmen foi coletado em vagina artificial, após exposição do touro a uma vaca manequim. A qualidade seminal foi avaliada quanto: o volume do ejaculado, concentração espermática por meio de espectrofotometria, a motilidade e o vigor por meio de microscopia óptica comum e a percentagem de anormalidades utilizando microscopia de contraste de fase, utilizando as metodologias propostas pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal14.
Tabela 1 - Consumo estimado da dieta dos animais durante o período experimental (Laboratório de Nutrição Animal, Departamento de Zootecnia, UFRGS)
Tabela 2 - Composição bromatológica e componentes dos ingredientes utilizados na formulação das dietas (Laboratório de Nutrição Animal, Departamento de Zootecnia, UFRGS)
Tabela 3 - Componentes da dieta subministrada aos animais durante o período experimental em percentagem de peso vivo (% PV). Central de Coleta e Processamento de sêmen, PROGEN
Para congelação as amostras de sêmen foram diluídas em citrato-gema com 4% de glicerol, envasadas em palhetas de 0,5 mL com uma concentração de 40 x 106 espermatozoides totais por dose, identificadas e colocadas em congelador automático MT 16812/0000® em curva automática de congelação entre -5°C a -120°C, duração do ciclo dez minutos e armazenadas em nitrogênio liquido a – 196°C para posteriores avaliações pós-descongelação. As partidas de sêmen foram descongeladas e avaliadas quanto a sua motilidade progressiva retilínea em microscópio óptico aumento 100X, integridade do acrossoma e diferenciação de espermatozoides viáveis de mortos por meio de uma coloração dupla (Tripan azul e Giemsa) que permite fazer uma avaliação simultânea de ambas as carateristicas2, de integridade da membrana plasmática por meio do teste hiposmótico (HO)15,16, submetendo aos espermatozoides a uma solução de 100 Mosm/L de citrato de sódio e frutose e avaliando cauda enrolada de não enrolada em microscópio óptico em aumento de 1000X, e longevidade dos espermatozoides pelo teste de termorresistência rápido (TTR/R)17, avaliando motilidade progressiva retilínea por microscopia óptica no momento da descongelação, e depois de um período de incubação de 30 e 60 minutos em banho termostático a 45°C18.
Também foram tomadas e conservadas congeladas duas amostras de soro para determinação da concentração de testosterona sérica. As amostras de sangue para análise de concentração de testosterona foram coletadas por meio de Vacutainer® e punção da veia coccígea em tubos sem anticoagulante para separação do soro. A concentração de testosterona em ng/mL foi medida por meio de radioimunoensaio (Kit RIA CT) que mede o esteroide na sua forma não conjugada19.
Para determinação da qualidade das pastagens e suplementos fornecidos durante o período experimental, foram feitas análises de matéria seca, cinzas, proteína, gordura, fibra, fibra em detergente ácida (FDA), fibra em detergente neutro (FDN), lignina e energia. Dos suplementos foi coletada uma só amostra antes do início do experimento, das pastagens foram coletadas amostras para análise a cada vinte dias durante o período experimental.
Analise Estatística
Na análise dos dados utilizou-se a análise de variância com medidas repetidas no tempo para dois tratamentos e quatro coletas. A primeira coleta foi usada como co-variável nas análises estatísticas com o fim de igualar os grupos quanto à qualidade seminal. A estrutura da matriz de covariância que resulta em melhor ajuste do modelo foi escolhida com base nos menores valores para o Critério de Informação de Akaike (AIC) e Critério de Informação Bayesiano Swarz (BIC). As informações sobre as variáveis motilidade espermática, percentagem de acrossomas íntegros e motilidade dos espermatozoides submetidos ao TTR/R aos 30 e 60 minutos foram transformadas em arco seno. O software utilizado foi o SAS e as medias comparadas pelo teste-t. O modelo matemático usado foi: Yijk = μ + τi + tj + (τ*t)ij + εijk ; onde: yijk = observação ijk-ésima observação; μ = média geral; τi= efeito do i-ésimo tratamento (i= 1 e 2); tj = efeito da j-ésima coleta (j=1,2,3 e 4); (τ*t)ij = efeito da ij-ésima interação entre o tratamento e a coleta; εijk = efeito do ijk-ésimo associado a ijk-ésima observação.
Resultados
O tipo de suplemento não afetou a concentração sérica de testosterona (P=0, 688), sendo a média e desvio padrão de 4,11 ± 2,15 mg/mL para touros suplementados com dieta funcional e de 4,73 ± 3,64 mg/ mL para aqueles suplementados com dieta energética.
Não foram notados efeitos do tipo de suplemento sobre o volume seminal (P=0, 5963) nem sobre a concentração espermática (P=0,5117). Por outro lado, o sêmen dos touros alimentados com dietas contendo suplemento funcional teve incrementos de 11% na motilidade (P=0,0443), 3% nos espermatozoides com acrossoma íntegro e 1,5% nos espermatozoides com membrana plasmática íntegra (P ≤ 0,05), quando comparado com o sêmen de touros recebendo suplemento energético (Tabela 4).
Foram encontradas interações entre tratamento e sessão de coleta para percentagens de espermatozoides com morfologia normal (P = 0,0344) e HO positivos (P = 0,0168) mostradas, respectivamente, nas figuras 1 e 2.
A motilidade espermática pós-descongelação não apresentou diferença entre os grupos suplementados. Os valores de espermatozoides com acrossoma íntegro foram superiores no grupo suplementado com sabões cálcicos de PUFA (P=0,0034), o que também aconteceu para percentagem de espermatozoides com membrana plasmática intacta (P=0,0056), quando comparado com o grupo que recebeu suplemento energético (Tabela 4).
O tipo de suplemento energético não afetou (P>0,05) a longevidade espermática aos 30 ou aos 60 minutos de incubação, nem o teste hipo-osmótico pós-descongelação (Tabela 4).
Discussão
O tipo de suplemento energético utilizado neste estudo não afetou o volume, a concentração de espermatozoides nem a concentração sérica de testosterona, confirmando os resultados de outros trabalhos onde os animais foram suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados PUFA12,20. Por outro lado, o sêmen in natura de touros alimentados com dietas contendo sabões cálcicos de PUFA teve incremento na motilidade espermática (83,3% vs. 75,3%), em concordância com vários estudos em diferentes espécies21,22,23,24, onde a suplementação com fontes de Omega-3 apresentou correlação positiva com o número de espermatozoides móveis25, além disto, no presente trabalho, houve incremento da percentagem de acrossomas íntegros (94,8% vs 91,8%) e percentagem de espermatozoides viáveis (98,0% vs 96,6%) em relação ao sêmen de touros recebendo suplemento energético. A análise multifatorial dos atributos da qualidade dos espermatozoides é a avaliação mais recomendável e apropriada para o diagnóstico da funcionalidade e integridade estrutural das células, visando estimar a habilidade fecundante do sêmen26,27, mesmo que seja de maior importância no sêmen após descongelação18, um sêmen in natura em boas condições, quando a metodologia de diluição e congelação otimamente aplicada, é um sêmen de melhor qualidade pós-descongelação.
Tabela 4 - Média ± desvios padrão das características seminais in natura e pós-criopreservação de touros alimentados com dietas contento suplementos funcional e energético
Figura 1 - Relação entre período da coleta e a percentual de espermatozoides morfologicamente normais em sêmen in natura de touros recebendo dois tipos de suplemento energético (SF: Suplemento Funcional; SE: Suplemento Energético). * Símbolo em cima das barras indica diferença significativa pelo teste-t (P ≤ 0.001) A primeira coleta durante o período experimental foi tomada como co-variável quando significativa
Figura 2 - Relação entre período da coleta e a percentual de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hipo-osmótico (HO) em sêmen in natura de touros recebendo dois tipos de suplemento energético (SF: Suplemento Funcional; SE: Suplemento Energético). * Símbolo em cima das barras indica diferença significativa pelo teste-t (P ≤ 0.001) A primeira coleta durante o período experimental foi tomada como co-variável quando significativa
As avaliações feitas em amostras do sêmen após congelação mostrou incrementos superiores a 20% em percentagens de espermatozoides com membrana acrossomal íntegra (48,0% vs 39,2%) e percentagens de espermatozoides viáveis (51,5% vs 42,2%). A suplementação de touros com sabões cálcicos de PUFA pode ajudar a diminuir as alterações morfológicas nas membranas dos espermatozoides induzidas pela criopreservação. Pettitt e Buhr28 reportaram modificações dos fosfolipídios do espermatozoide durante a criopreservação e posterior aquecimento, com maior dano sofrido pela membrana plasmática da cabeça. Posteriormente, Cerolini et al.29 acharam um decréscimo e uma mudança no arranjo dos fosfolipídios de espermatozoides submetidos a processos de congelação e descongelação.
A suplementação com ácidos graxos poli-insaturados tem mostrado efeitos positivos sobre a capacidade reprodutiva de machos adultos. A manipulação da dieta contendo PUFA muda a composição dos componentes dos espermatozoides de várias espécies domésticas30,31, melhorando as características físicas e metabólicas das membranas espermáticas, plasmática e acrossomal4. Dessa forma, pode se conferir homogeneidade aos espermatozoides e incrementar a possibilidade de que maior número chegue à junção útero-tubárica aumentando a probabilidade de fecundação4,32. Alguns estudos têm sugerido que a redução na motilidade e número de espermatozoides do ejaculado de touros podem ser decorrentes de deficiências de ácido docosaexaenóico (DHA) nos fosfolipídios da membrana espermática13. Sob as condições do presente estudo, pode se afirmar que a suplementação com sabões cálcicos de fontes de PUFA pode conferir às membranas espermáticas arranjos mais resistentes às injurias dos processos de criopreservação e posterior aquecimento.
Os touros do presente estudo pertencem a uma central de coleta e processamento de sêmen, submetidos, segundo a demanda, a várias coletas no percurso da semana. Estudos avaliando os efeitos de alta frequência de coletas sobre a qualidade seminal encontraram efeitos sobre motilidade espermática, localização de gota citoplasmática e incremento de algumas anormalidades no epidídimo e ejaculado33,34. A percentagem de espermatozoides morfologicamente normais do sêmen in natura no presente experimento exibiu uma interação significativa com a segunda sessão de coleta durante o período experimental, sendo maior nos touros suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados. Demonstrando uma possível relação entre percentagem de espermatozoides normais com a frequência de coletas às que os touros estavam sendo submetidos além do período experimental (Figura 1). Devido à impossibilidade de controlar manejos no interior das centrais, recomendamos realizar futuros estudos usando espectrofotometria de massas MALDI ou MALDI-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry), com o fim de estimar-se a efetiva incorporação dos ácidos graxos poli-insaturados nas membranas espermáticas.
Houve uma interação entre a percentagem de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hipo- -osmótico no sêmen in natura e as últimas duas sessões de coleta. A resposta foi melhor nos espermatozoides de touros suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados (Figura 2). Estudos avaliando a correlação do teste hiposmótico positivo com outros parâmetros de qualidade como motilidade e percentagens de espermatozoides com acrossoma íntegro observaram correlação positiva entre estes parâmetros, deduzindo que os testes de avaliação em conjunto demonstram a capacidade funcional dos espermatozoides no sêmen pré e pós-descogelamento15. No presente estudo, a percentagem de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hiposmótico no sêmen pós-descongelação não apresentou diferenças entre os grupos, porém, apresentou maiores percentagens em espermatozoides com membrana acrossomal íntegra e espermatozoides com membrana plasmática intacta, resultando em espermatozoides com maior capacidade funcional tanto no sêmen fresco como no sêmen pós-descogelação.
Segundo os resultados do presente estudo, a suplementação de touros com fontes de ácidos graxos poli- -insaturados melhora a motilidade dos espermatozoides e as características das membranas espermáticas, aumentando o número de espermatozoides viáveis e com membrana acrossomal íntegra, sobretudo no sêmen após ser exposto a processos de criopreservação, aumentando assim o valor agregado às biotécnicas como a inseminação artificial, transferência de embriões e fertilização in vitro de embriões, onde geralmente é usado sêmen após criopreservação.
Agradecimentos
Agradecimentos à empresa Química Geral do Nordeste (QGN) pelo fornecimento de recursos financeiros e matérias primas para realização do experimento e à CAPES pela disponibilização da bolsa PEC – PG.
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