Suplementação de touros com sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados e qualidade seminal pré e pós-congelação

Introdução

As biotécnicas da reprodução assistida são ferramentas atuais cada vez mais utilizadas nos sistemas de produção de bovinos na busca de eficiência reprodutiva. Deste modo, torna-se cada vez mais importante o entendimento dos fatores que podem influenciar os resultados em tais sistemas, entre eles a qualidade do sêmen¹.

A qualidade do sêmen afeta diretamente o desempenho reprodutivo do touro^2,3, pois as características seminais exercem um efeito importante desde o momento que os espermatozoides entram no trato reprodutivo da fêmea até o momento da fecundação⁴. Estudos têm detectado variações na fertilidade a partir de diferentes características seminais⁵ e mais recentemente alguns autores têm encontrado relações entre a concentração espermática, percentual de espermatozoides morfologicamente normais e a motilidade^3,6.

O nível energético tem sido abordado nos estudos da influência da nutrição sobre a produção, reprodução e qualidade seminal, sendo mais importante nos animais em desenvolvimento destinados a serem futuros reprodutores^7,8. Atualmente os estudos da influência da nutrição sobre a fertilidade bovina têm focado nas estratégias nutricionais para aumentar a qualidade dos espermatozoides nos machos e resposta nos programas de sincronização e qualidade do embrião nas fêmeas⁹. A suplementação com ácidos graxos tem sido orientada ao incremento do aporte energético na dieta, com o objetivo de melhorar o balanço energético. Recentemente, além da energia proporcionada pelos ácidos graxos, busca-se os benefícios que eles possuem como alimento funcional¹⁰.

Estudos demonstram que a suplementação de machos com ácidos graxos poli-insaturados melhora a qualidade seminal e incrementa os precursores de hormônios necessários para os processos reprodutivos^11,12. Em touros, os ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) podem melhorar a integridade e viabilidade da membrana espermática, além disso, Kelso et al.¹³ encontraram diminuição das concentrações de ácidos graxos poli-insaturados no plasma seminal com o envelhecimento dos indivíduos. Desta maneira, torna- -se muito importante avaliar os possíveis benefícios da suplementação com PUFA sobre a qualidade seminal em touros.

O objetivo do presente estudo foi avaliar as características do sêmen de touros suplementados com sabões cálcicos de PUFA, determinando o seu efeito sobre a qualidade seminal pré e pós-descongelação.

Material e Método

Local e duração do experimento

O experimento foi realizado na central de processamento e congelamento de sêmen PROGEN®, localizada no município de Dom Pedrito, RS, Brasil. O período experimental teve uma duração de 76 dias e foi iniciado com a pesagem, avaliação andrológica e início da suplementação dos animais. Foram realizadas cinco coletas de sêmen a cada quinze dias para avaliar a qualidade do sêmen in natura e, posteriormente, o sêmen foi congelado e avaliado pós-descongelação. As avaliações do sêmen in natura foram realizadas na PROGEN® enquanto as avaliações pós-descongelação foram realizadas no Laboratório de Reprodução Animal (REPROLAB) do Departamento de Medicina Animal da UFRGS.

Tratamentos

Avaliou-se o efeito de dois tipos de suplementos energéticos fornecidos para touros alimentados individualmente com volumosos cortados (pastagem de aveia ou cultivadas), ração comercial e sal mineral. Os tratamentos avaliados foram os seguintes:

Suplemento funcional: 200 g/d de sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados (Megalac-E®). (Fornecida por QGN Química Geral do Nordeste, Brasil) e
Suplemento energético: 745 g/d de raspa de Mandioca (Manihot esculenta, Crantz).

As dietas foram isoenergéticas (Tabela 1); a composição dos ingredientes das dietas está apresentada na tabela 2; enquanto, a razão entre a quantidade administrada de cada ingrediente dietário e o peso vivo dos animais está na tabela 3.

Animais e Manejo

Foram utilizados vinte touros das raças Angus, Brangus, Hereford e Braford, com peso médio de 950 kg e idade entre 4 e 10 anos. Cada animal foi considerado uma unidade experimental e alocado em um dos tratamentos mediante um processo de aleatorização estratificada, de modo a existirem animais de diferentes raças e idades similares dentro dos tratamentos.

Os touros estiveram alocados em vinte piquetes individuais de um hectare cada, divididos com cerca elétrica, cochos e bebedouros individuais. Os animais receberam volumoso verde cortado duas vezes ao dia e suplementação (fontes energéticas, ração comercial e sal) uma vez ao dia.

Coletas de sêmen

Foram realizadas cinco coletas de sêmen, sendo que a primeira foi feita ao início do experimento e tomada como referência pré-experimental. Posteriormente, os animais foram adaptados às dietas experimentais durante 15 dias. Após este período de adaptação, foram realizadas quatro coletas de sêmen com intervalo aproximado de 15 dias. O sêmen foi coletado em vagina artificial, após exposição do touro a uma vaca manequim. A qualidade seminal foi avaliada quanto: o volume do ejaculado, concentração espermática por meio de espectrofotometria, a motilidade e o vigor por meio de microscopia óptica comum e a percentagem de anormalidades utilizando microscopia de contraste de fase, utilizando as metodologias propostas pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal¹⁴.

Tabela 1 - Consumo estimado da dieta dos animais durante o período experimental (Laboratório de Nutrição Animal, Departamento de Zootecnia, UFRGS)

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Tabela 2 - Composição bromatológica e componentes dos ingredientes utilizados na formulação das dietas (Laboratório de Nutrição Animal, Departamento de Zootecnia, UFRGS)

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Tabela 3 - Componentes da dieta subministrada aos animais durante o período experimental em percentagem de peso vivo (% PV). Central de Coleta e Processamento de sêmen, PROGEN

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Para congelação as amostras de sêmen foram diluídas em citrato-gema com 4% de glicerol, envasadas em palhetas de 0,5 mL com uma concentração de 40 x 10⁶ espermatozoides totais por dose, identificadas e colocadas em congelador automático MT 16812/0000® em curva automática de congelação entre -5°C a -120°C, duração do ciclo dez minutos e armazenadas em nitrogênio liquido a – 196°C para posteriores avaliações pós-descongelação. As partidas de sêmen foram descongeladas e avaliadas quanto a sua motilidade progressiva retilínea em microscópio óptico aumento 100X, integridade do acrossoma e diferenciação de espermatozoides viáveis de mortos por meio de uma coloração dupla (Tripan azul e Giemsa) que permite fazer uma avaliação simultânea de ambas as carateristicas², de integridade da membrana plasmática por meio do teste hiposmótico (HO)^15,16, submetendo aos espermatozoides a uma solução de 100 Mosm/L de citrato de sódio e frutose e avaliando cauda enrolada de não enrolada em microscópio óptico em aumento de 1000X, e longevidade dos espermatozoides pelo teste de termorresistência rápido (TTR/R)¹⁷, avaliando motilidade progressiva retilínea por microscopia óptica no momento da descongelação, e depois de um período de incubação de 30 e 60 minutos em banho termostático a 45°C¹⁸.

Também foram tomadas e conservadas congeladas duas amostras de soro para determinação da concentração de testosterona sérica. As amostras de sangue para análise de concentração de testosterona foram coletadas por meio de Vacutainer® e punção da veia coccígea em tubos sem anticoagulante para separação do soro. A concentração de testosterona em ng/mL foi medida por meio de radioimunoensaio (Kit RIA CT) que mede o esteroide na sua forma não conjugada¹⁹.

Para determinação da qualidade das pastagens e suplementos fornecidos durante o período experimental, foram feitas análises de matéria seca, cinzas, proteína, gordura, fibra, fibra em detergente ácida (FDA), fibra em detergente neutro (FDN), lignina e energia. Dos suplementos foi coletada uma só amostra antes do início do experimento, das pastagens foram coletadas amostras para análise a cada vinte dias durante o período experimental.

Analise Estatística

Na análise dos dados utilizou-se a análise de variância com medidas repetidas no tempo para dois tratamentos e quatro coletas. A primeira coleta foi usada como co-variável nas análises estatísticas com o fim de igualar os grupos quanto à qualidade seminal. A estrutura da matriz de covariância que resulta em melhor ajuste do modelo foi escolhida com base nos menores valores para o Critério de Informação de Akaike (AIC) e Critério de Informação Bayesiano Swarz (BIC). As informações sobre as variáveis motilidade espermática, percentagem de acrossomas íntegros e motilidade dos espermatozoides submetidos ao TTR/R aos 30 e 60 minutos foram transformadas em arco seno. O software utilizado foi o SAS e as medias comparadas pelo teste-t. O modelo matemático usado foi: Yijk = μ + τ_i + t_j + (τ*t)_ij + ε_ijk ; onde: y_ijk = observação ijk-ésima observação; μ = média geral; τ_i= efeito do i-ésimo tratamento (i= 1 e 2); t_j = efeito da j-ésima coleta (j=1,2,3 e 4); (τ*t)_ij = efeito da ij-ésima interação entre o tratamento e a coleta; ε_ijk = efeito do ijk-ésimo associado a ijk-ésima observação.

Resultados

O tipo de suplemento não afetou a concentração sérica de testosterona (P=0, 688), sendo a média e desvio padrão de 4,11 ± 2,15 mg/mL para touros suplementados com dieta funcional e de 4,73 ± 3,64 mg/ mL para aqueles suplementados com dieta energética.

Não foram notados efeitos do tipo de suplemento sobre o volume seminal (P=0, 5963) nem sobre a concentração espermática (P=0,5117). Por outro lado, o sêmen dos touros alimentados com dietas contendo suplemento funcional teve incrementos de 11% na motilidade (P=0,0443), 3% nos espermatozoides com acrossoma íntegro e 1,5% nos espermatozoides com membrana plasmática íntegra (P ≤ 0,05), quando comparado com o sêmen de touros recebendo suplemento energético (Tabela 4).

Foram encontradas interações entre tratamento e sessão de coleta para percentagens de espermatozoides com morfologia normal (P = 0,0344) e HO positivos (P = 0,0168) mostradas, respectivamente, nas figuras 1 e 2.

A motilidade espermática pós-descongelação não apresentou diferença entre os grupos suplementados. Os valores de espermatozoides com acrossoma íntegro foram superiores no grupo suplementado com sabões cálcicos de PUFA (P=0,0034), o que também aconteceu para percentagem de espermatozoides com membrana plasmática intacta (P=0,0056), quando comparado com o grupo que recebeu suplemento energético (Tabela 4).

O tipo de suplemento energético não afetou (P>0,05) a longevidade espermática aos 30 ou aos 60 minutos de incubação, nem o teste hipo-osmótico pós-descongelação (Tabela 4).

Discussão

O tipo de suplemento energético utilizado neste estudo não afetou o volume, a concentração de espermatozoides nem a concentração sérica de testosterona, confirmando os resultados de outros trabalhos onde os animais foram suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados PUFA^12,20. Por outro lado, o sêmen in natura de touros alimentados com dietas contendo sabões cálcicos de PUFA teve incremento na motilidade espermática (83,3% vs. 75,3%), em concordância com vários estudos em diferentes espécies^21,22,23,24, onde a suplementação com fontes de Omega-3 apresentou correlação positiva com o número de espermatozoides móveis²⁵, além disto, no presente trabalho, houve incremento da percentagem de acrossomas íntegros (94,8% vs 91,8%) e percentagem de espermatozoides viáveis (98,0% vs 96,6%) em relação ao sêmen de touros recebendo suplemento energético. A análise multifatorial dos atributos da qualidade dos espermatozoides é a avaliação mais recomendável e apropriada para o diagnóstico da funcionalidade e integridade estrutural das células, visando estimar a habilidade fecundante do sêmen^26,27, mesmo que seja de maior importância no sêmen após descongelação18, um sêmen in natura em boas condições, quando a metodologia de diluição e congelação otimamente aplicada, é um sêmen de melhor qualidade pós-descongelação.

Tabela 4 - Média ± desvios padrão das características seminais in natura e pós-criopreservação de touros alimentados com dietas contento suplementos funcional e energético

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Figura 1 - Relação entre período da coleta e a percentual de espermatozoides morfologicamente normais em sêmen in natura de touros recebendo dois tipos de suplemento energético (SF: Suplemento Funcional; SE: Suplemento Energético). * Símbolo em cima das barras indica diferença significativa pelo teste-t (P ≤ 0.001) A primeira coleta durante o período experimental foi tomada como co-variável quando significativa

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Figura 2 - Relação entre período da coleta e a percentual de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hipo-osmótico (HO) em sêmen in natura de touros recebendo dois tipos de suplemento energético (SF: Suplemento Funcional; SE: Suplemento Energético). * Símbolo em cima das barras indica diferença significativa pelo teste-t (P ≤ 0.001) A primeira coleta durante o período experimental foi tomada como co-variável quando significativa

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As avaliações feitas em amostras do sêmen após congelação mostrou incrementos superiores a 20% em percentagens de espermatozoides com membrana acrossomal íntegra (48,0% vs 39,2%) e percentagens de espermatozoides viáveis (51,5% vs 42,2%). A suplementação de touros com sabões cálcicos de PUFA pode ajudar a diminuir as alterações morfológicas nas membranas dos espermatozoides induzidas pela criopreservação. Pettitt e Buhr²⁸ reportaram modificações dos fosfolipídios do espermatozoide durante a criopreservação e posterior aquecimento, com maior dano sofrido pela membrana plasmática da cabeça. Posteriormente, Cerolini et al.²⁹ acharam um decréscimo e uma mudança no arranjo dos fosfolipídios de espermatozoides submetidos a processos de congelação e descongelação.

A suplementação com ácidos graxos poli-insaturados tem mostrado efeitos positivos sobre a capacidade reprodutiva de machos adultos. A manipulação da dieta contendo PUFA muda a composição dos componentes dos espermatozoides de várias espécies domésticas^30,31, melhorando as características físicas e metabólicas das membranas espermáticas, plasmática e acrossomal⁴. Dessa forma, pode se conferir homogeneidade aos espermatozoides e incrementar a possibilidade de que maior número chegue à junção útero-tubárica aumentando a probabilidade de fecundação^4,32. Alguns estudos têm sugerido que a redução na motilidade e número de espermatozoides do ejaculado de touros podem ser decorrentes de deficiências de ácido docosaexaenóico (DHA) nos fosfolipídios da membrana espermática¹³. Sob as condições do presente estudo, pode se afirmar que a suplementação com sabões cálcicos de fontes de PUFA pode conferir às membranas espermáticas arranjos mais resistentes às injurias dos processos de criopreservação e posterior aquecimento.

Os touros do presente estudo pertencem a uma central de coleta e processamento de sêmen, submetidos, segundo a demanda, a várias coletas no percurso da semana. Estudos avaliando os efeitos de alta frequência de coletas sobre a qualidade seminal encontraram efeitos sobre motilidade espermática, localização de gota citoplasmática e incremento de algumas anormalidades no epidídimo e ejaculado^33,34. A percentagem de espermatozoides morfologicamente normais do sêmen in natura no presente experimento exibiu uma interação significativa com a segunda sessão de coleta durante o período experimental, sendo maior nos touros suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados. Demonstrando uma possível relação entre percentagem de espermatozoides normais com a frequência de coletas às que os touros estavam sendo submetidos além do período experimental (Figura 1). Devido à impossibilidade de controlar manejos no interior das centrais, recomendamos realizar futuros estudos usando espectrofotometria de massas MALDI ou MALDI-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry), com o fim de estimar-se a efetiva incorporação dos ácidos graxos poli-insaturados nas membranas espermáticas.

Houve uma interação entre a percentagem de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hipo- -osmótico no sêmen in natura e as últimas duas sessões de coleta. A resposta foi melhor nos espermatozoides de touros suplementados com fontes de ácidos graxos poli-insaturados (Figura 2). Estudos avaliando a correlação do teste hiposmótico positivo com outros parâmetros de qualidade como motilidade e percentagens de espermatozoides com acrossoma íntegro observaram correlação positiva entre estes parâmetros, deduzindo que os testes de avaliação em conjunto demonstram a capacidade funcional dos espermatozoides no sêmen pré e pós-descogelamento¹⁵. No presente estudo, a percentagem de espermatozoides que reagiram positivamente ao teste hiposmótico no sêmen pós-descongelação não apresentou diferenças entre os grupos, porém, apresentou maiores percentagens em espermatozoides com membrana acrossomal íntegra e espermatozoides com membrana plasmática intacta, resultando em espermatozoides com maior capacidade funcional tanto no sêmen fresco como no sêmen pós-descogelação.

Segundo os resultados do presente estudo, a suplementação de touros com fontes de ácidos graxos poli- -insaturados melhora a motilidade dos espermatozoides e as características das membranas espermáticas, aumentando o número de espermatozoides viáveis e com membrana acrossomal íntegra, sobretudo no sêmen após ser exposto a processos de criopreservação, aumentando assim o valor agregado às biotécnicas como a inseminação artificial, transferência de embriões e fertilização in vitro de embriões, onde geralmente é usado sêmen após criopreservação.

Agradecimentos

Agradecimentos à empresa Química Geral do Nordeste (QGN) pelo fornecimento de recursos financeiros e matérias primas para realização do experimento e à CAPES pela disponibilização da bolsa PEC – PG.

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