metodologias analíticas amostragem micotoxinas

Micotoxinas são metabólitos secundários de fungos filamentosos de diferentes linhagens que se desenvolvem em diversos produtos de origem agrícola, ainda na lavoura e também no período de estocagem. Estas espécies provocam efeitos tóxicos, carcinogênicos e teratogênicos, tanto em animais quanto em humanos que consumam alimentos contaminados.

São conhecidas mais de 300 micotoxinas, sendo que, dentre as de maior significância, destacamos aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona, fumonisinas, além de alguns tricotecenos como desoxinivalenol e toxina T-2. A presença destas espécies tem um significante impacto em termos não só de saúde pública, mas também econômico, sendo que a melhor maneira de evitar intoxicações é a prevenção do desenvolvimento dos fungos produtores através de boas práticas de plantio, colheita e armazenamento. Porém, devido a fatores como condições climáticas e carências tanto tecnológicas quanto de conhecimento técnico, normalmente é bastante difícil criar e manter as condições adequadas para cessar/retardar o crescimento fúngico.

A partir deste quadro, torna-se necessário o acompanhamento de todo o processo produtivo, desde a lavoura até o produto pronto para consumo, a fim de identificar/quantificar a presença destas toxinas. Para isso, é necessário que se disponha de estratégias e ferramentas de controle de qualidade que sejam capazes de realizar esta tarefa de forma simples, rápida e confiável, além de envolver o menor custo possível.

No decorrer dos últimos anos, as legislações dos países de todo o mundo têm-se tornado cada vez mais rígidas no que tange a presença de resíduos de micotoxinas em alimentos, tanto de origem vegetal, quanto de origem animal. Acompanhando esta evolução, têm-se promovido o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas de amostragem e análise, a fim de garantir a representatividade e a acurácia de resultados emitidos, a partir da aplicação de sistemas de controle de qualidade de alimento.

Neste trabalho, serão apresentados os últimos avanços em termos de estratégias de amostragem e técnicas analíticas, a sua importância no controle da presença de micotoxinas em alimentos, além do seu potencial para a aplicação prática em monitoramento de rotina. Tópicos envolvendo ensaios de avaliação da capacidade de adsorção de aditivos anti-micotoxinas (AAM) serão também abordados.

Diversos programas amostrais podem ser empregados no processo de análise de micotoxinas. Todos possuem vantagens e desvantagens determinadas, principalmente, pela distribuição heterogênea dos grãos contaminados com micotoxinas na massa de cereais. Assim esta variável leva a inúmeras dificuldades de interpretação das análises e de diagnóstico. O problema é agravado pelo fato de as micotoxinas se encontrarem em níveis de μg kg-1. No caso, por exemplo, de miho, principal componente das rações de suínos, 1 bilhão de grãos corresponde a aproximadamente 350 T, ou seja, 1 μg kg-1 seria o equivalente a 1 grão distribuído em 10 caminhões de 35 T.

Para efeitos práticos, tomando-se todo o processo, determinação de micotoxinas são compostas pela colheita da amostra, a sua moagem, sub-amostragem e, finalmente, a sua análise. A cada um destes passos está associado um determinado grau de desvio definido pela variabilidade dos resultados, o que torna difícil a determinação exata da contaminação por micotoxinas em um lote de alimento. Por isso uma série de cuidados devem ser tomados para minimizar os desvios de resultados.

Após a coleta de uma amostra de determinado lote, é realizada a subamostragem, onde retira-se uma alíquota a ser destinada para análise. Nesta última etapa, após moagem e particionamento, apenas uma pequena porção da amostra é utilizada. Durante a moagem, um certo grau de homogeneização é alcançado, sendo que partículas contaminadas ficam distribuídas de forma menos heterogênea, o que diminui a variabilidade de resultados obtidos a partir de diferentes sub-amostras de uma mesma amostra.

A ampla incerteza e a baixa representatividade são problemas constantemente enfrentados durante a amostragem. Entretanto, a variância das análises pode ser reduzida aumentando-se o volume de amostra (e sub-amostra) e o número de pontos de amostragem (assim como o número de sub-amostras); diminuindo-se o tamanho de partícula durante a moagem; e utilizando tecnologias automatizadas e que propiciem a maior precisão possível.

Em casos de suspeita de micotoxicoses, além da já referida heterogeneidade deve-se considerar a toxicocinética das micotoxinas para que o diagnóstico presuntivo possa ser confirmado através do diagnóstico etiológico.

Em casos de amostragem com fins legais, deve-se empregar o serviço oficial de amostragem ou, quando isto não for possível, as partes interessadas deverão estar presentes durante a colheita da amostra. Entretanto, independente da situação, um plano amostral deve ser seguido respeitando-se padrões operacionais. Em alguns casos, a amostra deve ser recolhida o mais próximo possível do local em que o animal intoxicado consumiu o alimento (comedouros).

Principalmente em situações onde este alimento não se encontra mais disponíveis, indícios importantes podem ser obtidos através da coleta de sangue e órgãos. Isto pode permitir o rastreamento de contaminação. Algumas micotoxicoses, como a causada pela ocratoxina A, são detectáveis no soro sanguíneo por até 35 dias após a ingestão da toxina.

Deve-se atentar também para o acondicionamento e envio dos materiais, visto que, amostras que apresentem condições adequadas ao crescimento fúngico (por exemplo, atividade de água (Aw) acima dos limites) podem favorecer o desenvolvimento, fazendo com que a amostra deixe de ser representativa.

Voltando-se às etapas iniciais no processo de colheita de amostras, duas estratégias podem ser adotadas em uma fábrica de rações: amostragem de recebimentoe/ou amostragem de produção.Nas duas situações devemos sempre avaliar suas vantagens e desvantagens, além dos custos e riscos associados a elas.

No caso da amostragem de recebimento, a coleta dá-se no momento da chegada das matérias-primas componentes das rações. O uso desta estratégia visa obter dados antecipados a serem usados na prevenção de riscos futuros, na garantia da qualidade do produto acabado, além de possibilitar o uso das informações na seleção dos fornecedores e na aquisição de matéria-prima de maior qualidade em compras futuras. Este tipo de estratégia é especialmente útil como ferramenta na cadeia da qualidade de todo o processo produtivo. Isto porque, em termos micotoxicológicos, as condições dos produtos de origem animal dependem da inexistência de contaminantes na ração utilizada em sua dieta.

Um segundo momento que permite uma amostragem eficiente ocorre no processamento final da produção da ração ou alimento (amostragem de produção). Esta amostragem permite a verificação de toda a contaminação que ocorreu na matéria-prima durante as etapas de cultivo, colheita, transporte, secagem, armazenamento e beneficiamento.

Quando a estratégia utilizada é a amostragem de recebimento, pressupõe-se uma boa armazenagem dos cereais, não prevendo a formação de micotoxinas durante esta etapa. No caso da amostragem de processo, a coleta deve acontecer no ponto mais próximo da mistura das matérias primas, onde há uma maior homogeneização das partículas. Um ponto prático e usual para a tomada dos incrementos localiza-se logo após a moagem, onde usualmente controla-se a granulometria e eficiência do processo.

Deve-se tomar cuidado especial para evitar a formação de água de condensação na amostra coletada, principalmente quando são utilizadas embalagens plásticas ou amostras acima da temperatura ambiente. O volume dos incrementos tomados deve representar todo o lote. A homogeneização é indispensável, podendo ser realizada em misturador em “Y” ou quarteador. Na falta destes equipamentos pode-se utilizar o sistema de redução de amostras em cruz até obter um peso de amostras de aproximadamente 2 kg (amostra e contraprova). Após, o material deve ser embalado, lacrado e mantido em condições que permitam a manutenção de suas características até a chegada no laboratório de análise.

O crescente desenvolvimento na química analítica tem propiciado a popularização de técnicas relativamente novas e a evolução e readequação de outras já fundamentadas. No caso de análises micotoxicológicas não é diferente. O resultado disto é a disponibilidade de uma série de alternativas para a determinação inequívoca de diferentes espécies, em diferentes matrizes e em concentrações cada vez mais baixas.

Classicamente, micotoxinas têm sido determinadas através de técnicas imunoenzimáticas. Elas baseiam-se na interação entre anticorpos e antígenos (neste caso, a micotoxina de interesse). Anticorpos são altamente específicos para compostos que diferem acentuadamente em termos estruturais. Entretanto, em se tratando de compostos análogos, são comuns reações cruzadas, o que é o caso de micotoxinas. O tipo mais comum de imunoensaio é o chamado ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay”) que usa como forma de detecção desde simples comparação visual de cores até métodos mais complexos como espectrofotometria, amperometria e voltametria de pulso diferencial. Outra técnica clássica em análises micotoxicológicas é a cromatografia de camada delgada (CCD) que propicia separação e análises qualitativas e semi-quantitativas por simples visualização comparativa ou medidas densitométricas.

Ambas estas técnicas apresentam como grandes vantagens sua razoável sensibilidade, rapidez e baixo custo, sendo que a sua simplicidade permite que analistas não-especializados realizem as determinações sem maiores problemas. Estas técnicas eram amplamente utilizadas para fins quantitativos sem o uso de métodos de confirmação. Entretanto, pela grande susceptibilidade a falsos positivos e superestimação de concentração; e frente à popularização de técnicas cromatográficas instrumentais mais especificas, a sua aplicação tem sido, atualmente, mais direcionada a análises de screening com utilização, principalmente, de cromatografia líquidaespectrometria de massas (LC-MS) como técnica de escolha em análises de confirmação.

Após a massificação do uso de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), esta tecnologia tornou-se uma importante ferramenta em análises de micotoxinas, especialmente quando utilizada em fase reversa. Tais condições criaram importantes alternativas em termos de separação cromatográfica, uma vez que uma grande variedade de fases estacionárias tornou-se disponível. Devido à fluorescência de compostos como aflatoxinas e fumonisinas a utilização de detectores de fluorescência tornou-se bastante comum. Através de reações de derivatização pré ou pós-coluna é possível obter produtos com ainda maior capacidade de fluorescência, o que potencializa ainda mais esta técnica de detecção. Entretanto, estes procedimentos de derivatização demandam tempo e aumentam a probabilidade de erros nas análises. Alem disso, devido à complexidade das matrizes envolvidas, o uso de HPLC requer igualmente morosos passos de clean-up.

Os mesmos problemas estavam vinculados ao uso de cromatografia a gásespectrometria de massas (GC-MS). Reações de derivatização são também necessárias para a obtenção de produtos suficientemente voláteis para serem determinadas através da técnica. Em muitos casos, clean-up e/ou pré-concentração eram também necessários. Independente destas limitações, o uso de espectrometria de massas como técnica de detecção provocou grandes avanços em termos de seletividade e a técnica passou a ser uma excelente ferramenta em análises de confirmação.

Métodos envolvendo o uso de LC-MS foram raramente utilizados até a segunda metade dos anos 90, quando avanços na fonte de ionização e na interface entre as zonas de pressão atmosférica e de vácuo aumentaram a sua robustez, praticidade, seletividade, exatidão, seletividade e compatibilidade com diferentes compostos em uma ampla faixa de polaridade. Esta técnica dispensa o uso de derivatização o que torna os métodos mais rápidos e práticos. O potencial de LC-MS novamente voltou a crescer com o surgimento da cromatografia líquida-espectrometria de massas seqüencial (LC-MS/MS). A possibilidade de isolar e identificar fragmentos formados a partir da quebra de íons precursores aumentou sensivelmente a capacidade de determinar de forma inequívoca a presença de compostos orgânicos. Como conseqüência disto foi possível também determinar concentrações ainda mais baixas destas espécies.

A dinâmica dos avanços em análises micotoxicológicas são ditados pela necessidade de métodos cada vez mais rápidos e simples, e que se prestem para a determinação - em regime de rotina pesada, de micotoxinas que apresentam ocorrência concomitante em baixas concentrações em amostras de várias diferentes matrizes.

A maior especificidade e sensibilidade de LC-MS/MS vem propiciando o desenvolvimento de métodos que dispensam procedimentos de clean-up e/ou préconcentração, além de diminuir de forma significativa a necessidade de separação cromatográfica entre diferentes compostos. Assim, vem sendo possível analisar simultaneamente várias toxinas utilizando-se os chamados métodos multi-resíduos. Desta forma, o maior limitante é obter condições de extração que sejam adequadas e compatíveis aos diferentes analitos, que, na maioria dos casos, apresentam uma grande diversidade em termos de propriedades químicas e que interagem de forma diferente frente aos solventes. Feito isto, um único procedimento de extração, separação e análise é empregado, o que simplifica o método como um todo, além de aumentar seu “throughput”.

A utilização de LC-MS e LC-MS/MS vem propiciando análises na faixa de ng L- 1 - μg L-1, sendo que o estado-da-arte atualmente é o desenvolvimento de métodos que sejam suficientemente robustos para o seu uso em análises de rotina pesada.

Avanços na área de separação como a cromatografia líquida bidimensional (LCLC) e cromatografia rápida, levam à emissão de resultados de forma sensivelmente mais rápida e mais segura, e garantem LC-MS/MS como a primeira escolha em termos de análises micotoxicológicas. Contudo, o futuro poderá estar no uso de técnicas nãoinvasivas como espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo (NIRS) que não necessitam de nenhum preparo de amostra e que possibilitam análises remotas e de custo inferior.

O uso de aditivos anti-micotoxinas (AAM) na indústria de alimentação animal vem cada vez mais ganhando espaço. Eles atuam no seqüestro das micotoxinas, com o objetivo de reduzir a absorção destas espécies no trato gastrointestinal dos animais.

Os AAM mais utilizados são à base de aluminosilicatos de cálcio e sódio hidratado (HSCAS), carvão ativado, colestiramina, glucomanano e argila, sendo que sua eficiência depende das características estruturais tanto das micotoxinas quanto dos próprios AAM, bem como de suas propriedades químicas. Espécies com diferentes polaridades apresentam diferentes interações com diferentes tipos de AAM. Em alguns casos, a baixa polaridade de determinadas toxinas torna ineficazes sequestrantes como os aluminosilicatos que são conhecidos por sua atração por espécies polares. Nestes casos, é comum serem adicionados à formulação dos produtos glicomananos esterificados componentes da parede interna das leveduras, ou ainda organismos vivos tais como bactérias. Isto provoca a bio-tranformação das toxinas através de reações enzimáticas ou processos microbiológicos (hidroxilação, de-epoxilação ou deacetilação), aumentando assim a hidrofilicidade destas espécies e a maior susceptibilidade à ação do sequestrante.

A real eficiência dos AAM é avaliada através de testes de adsorção in vitro e in vivo, sendo que a tomada de decisão ao optar por um determinado produto deve ser baseada em resultados obtidos através destes testes. As avaliações in vitro de um adsorvente têm como objetivo principal determinar a sua capacidade de adsorver micotoxinas presentes em um meio líquido, tornando-as assim indisponíveis. Tomando-se a realidade brasileira, para a comercialização de um AAM ele deve ser devidamente registrado no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), sendo este registro obtido somente mediante a comprovação de sua eficiência através de avaliação in vivo. A manutenção deste registro é realizada mediante apresentação, semestralmente, de um laudo de avaliação in vitro com resultado satisfatório. Tanto as avaliações in vivo como in vitro devem ser realizadas em laboratório credenciado pelo MAPA.

Atualmente, apesar do mercado brasileiro dispor de uma variada oferta de AAM, somente um pequeno número deles apresentam resultados que realmente comprovam sua eficiência protetora.

As primeiras metodologias descritas para estudos in vitro de avaliação de eficiência de AAM começaram a ser desenvolvidas a mais de 20 anos e utilizavam como veículo para a aflatoxina, uma solução hidroalcoólica. Apesar desta condição ser amplamente utilizada atualmente, quando no organismo animal, o adsorvente é submetido a situações que, obviamente, não são reproduzidas em ensaios com solução hidroalcoólica. Estudos visando mimetizar o ambiente do trato gastrointestinal (TGI), local de ação dos AAM no organismo, vem sendo já realizados. Netas investigações foram levadas em consideração fatores como pH do meio, presença de enzimas digestivas e tempo de contato entre adsorvente e micotoxina.

Com mais de 20 anos de experiência, o Laboratório de Análises Micotoxicológicas (LAMIC) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), juntamente com o Instituto de Soluções Analíticas Microbiológicas e Tecnológicas Ltda. (SAMITEC) têm realizado testes de avaliação de AAM utilizando ensaios in vitro que empregam suco gástrico e intestinal, condições que melhor representam aquelas encontradas in vivo. Estas condições estão descritas na farmacopéia americana e são amplamente aceitas em todo o mundo. Tomandose os resultados obtidos, preconiza-se capacidade de adsorção de 90% da concentração de micotoxina como índice mínimo aceitável.

Segundo dados obtidos a partir de 1056 avaliações realizadas no LAMIC num período de 1998 a 2009, cerca de 50 % dos AAM investigados apresentaram capacidade de adsorção superior a 90% em ensaios in vitro. Porém, esse índice não corresponde ao desempenho apresentado pelos produtos nos ensaios in vivo. Aproximadamente um quarto dos produtos reprovados em testes in vivo para as principais micotoxinas em aves e suínos apresentam capacidade de adsorção maior que 90% em estudos in vitro. Da mesma forma, de janeiro de 2004 a agosto 2009, período em que 65 AAM tiveram sua capacidade como sequestrante de aflatoxinas, fumonisinas e zearalenona em aves e suínos avaliados, 42% dos aprovados em ensaios in vivo apresentaram capacidade de adsorção in vitro inferior a 90% (testes em pH 3). Desta forma, fica evidente também que, mesmo produtos que se mostraram inadequados em situações menos realísticas como as encontradas em ensaios in vitro, podem muitas vezes apresentar desempenho satisfatório em ensaios de campo. Submetendo estes mesmos dados a uma análise de regressão linear, verificou-se não haver correlação significativa entre os teste in vivo e in vitro, independente das condições empregadas nestes últimos (P ≤ 0,05 e R ≤ 0,45).

A partir destes dados fica claro que resultados obtidos através de avaliações in vitro não são suficientes para a comprovação da eficácia de um AAM. Para isto, são necessários resultados satisfatórios obtidos através de ensaios in vivo. Isto ocorre devido ao fato de que, mesmo reproduzindo as condições do meio, através dos sucos do TGI, o teste in vitro é não mais que uma simulação grosseira e deve servir apenas como uma triagem de fontes destes produtos, bem como utilizado no controle de qualidade dos diferentes lotes dos AAM previamente aprovados em teste in vivo.