macroscópica fúngica aflatoxinas milho

Uma grande quantidade de fungos toxigê nicos podem contaminar os cereais, principalmente em regiões de clima tropical. ASEVÊDO et aI. (1994) e ORSI et aI. (1995) demostraram que o gênero fúngÍco maÍs encontrado no milho recém colhido foi Fusarium, seguido por Aspergillus e Penicillium. Levantamento feito por SALGADO et aI. (1980) em amostras de milho, trigo e arroz, pro-venientes do estado de Santa Catarina, mostrou que 90% das amostras eram positivas para Fusarium moniliforme e Fusarium graminearum. Pozzi, apud CORRÊA (1995), pesquisou mensalmente a microbiota fúngica de 130 amostras de milho. Os gêneros mais encontrados foram: Fusarium 83,8%; Penicillium 55,3% e Aspergillus em 40,7% das amostras analisadas.

A contaminação dos cereais por fungostoxigênicos e produção de micotoxinas nos mesmospodem dar-se ainda no período pré-colheita, depen-dendo da espécie de planta envolvida, fatores geo-gráficos e climáticos e manipulação dos mesmos nacolheita, transporte, secagem, armazenamento e beneficiamento (ANDERSON et ai., 1975; FENNELL et ai., 1975; LILLEHOJ, et ai., 1976;ORGANISACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD,1983; CRUZ, 1995). ZERINGUE et ai. (1996) suge-rem que as variações nas concentrações de aflatoxinas(AFs), encontradas em diferentes híbridos de milho,estejam relacionadas à concentração de ácidolinoleico e da enzima lipoxigenase. A lipoxigenaçãodo ácido linoleico seria capaz de produzir aldeídosvoláteis com cadeias de 6 até 12 carbonos, inibindo ouimpedindo o crescimento de fungos e a formação de AFs.

As AFs são metabólitos secundários de fungos das espécies Aspergillus flavus e Aspergillusparasiticus. Segundo LEESON et ai. (1995), cerca de 50% das espécies de A. flavus e A. parasiticus são produtores de AFs. Somente quatro foram iden-tificadas como contaminantes naturais de produtosagrícolas. São denominadas aflatoxina B" (AFBt); B2,(AFB2); Gh (AFG1); G2, (AFG2). A AFBl é a maistóxica do grupo, seguida pela AFGj, AFB2 e AFG2com toxicidade de 50%, 20% e 10% em relação à primeira, respectivamente (SHOTWELL et ai., 1966; LEESON etal., 1995).

Em cereais estocados, os fatores mais im-portantes para o crescimento de fungos toxigênicos do gênero Aspergillus e a produção de AFs são aumidade relativa do ar e do substrato e temperatura dearmazenamento. Umidade relativa de 80 a 85% com17% de umidade dos cereais e temperatura de 24 a35°C são condições ótimas para a produção de AFs(LEESON et ai., 1995). O crescimento fúngicodificilmente ocorre em cereais que apresentam umi-dade inferior a 12% (REDDY, 1992). Em rações,ótimas condições para a produção de AFs foramencontradas com umidade de 10 a 13% do substrato,79 a 89% de umidade relativa do ar e temperaturas de19 a 27°C (JONES et ai., 1982). SegundoORGANISACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD(1983), as temperaturas mínima, ótima e máxima para a produção das AFs sãQ de 12°C, 27°C e 40 42°C, respectivamente.

Este estudo objetivou a análise da conta-minação natural por fungos e micotoxinas de cinco híbridos de milho. Quantificou-se a contaminação pelos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium. As micotoxinas pesquisadas foram: AFs, ocratoxina A, zearalenona e fumonisina B I. Em paralelo, classi-ficaram-se também os diferentes híbridos em per-centagem de grãos íntegros, danificados por insetos e danificados por fungos, e cultivou-se Aspergillus parasiticus linhagem NRRL 2999 no milho íntegro para comparar o potencial de produção de AFs entre os diferentes híbridos e o consumo de matéria seca.

Os cinco híbridos de milho avaliados,numerados de 1 a 5, foram coletados aleatoriamentede uma lavoura experimental do Departamento deSolos do Curso de Agronomia da UniversidadeFederal de Santa Maria, onde se cultivaram outros 20híbridos de diferentes marcas comerciais. O cultivofoi conduzido em parcelas de 60m2 com trêsrepetições para cada híbrido. De cada híbrido foramcolhidos aproximadamente 20kg de milho em espiga,que foi debulhado manualmente, evitando-se danomecânico. Essa foi realizada no mês de março de1996, após a maturação fisiológica do cereal.

 

Quantificação da contaminação fúngica dos híbridos

A quantificação da contaminação fúngica foi realizada conforme a metodologia preconizada por SAMSON et ai. (1996). Colocaram-se 10 grãos de milho no meio de DRBC AGAR BASE@ (OXOID UNIP A TH Ltda., Basingstoke, Hampshire, England), em placa de Petri, com cinco repetições por híbrido. O período de incubação foi de 5 dias a 25°C. Em seguida, fez-se a identificação dos fungos que se desenvolveram nos grãos com o auxílio de estereoscópio (Leitz Wetzlar, modelo 490348) e microscópio (Leitz Wetzlar, modelo 736916).

Classificação macroscópica dos híbridos de milho

Realizaram-se a seleção e separação ma-nual de três amostras de lkg de cada híbrido em grãos íntegros, os que não apresentaram lesões provocadas por insetos ou alteração da coloração provocada pelo desenvolvimento fúngico (ardido). O segundo grupo foi formado por grãos danificados por insetos (DI) e outro por grãos que apresentaram danos provocados pelo desenvolvimento fúngico (DF). Grãos de todos os híbridos, que não apresentaram danos físicos nem contaminação fúngica aparente, foram selecionados para a inoculação fúngica e cultivo para a avaliação do potencial de produção de AFs de cada híbrido.

Preparação dos híbridos de milho e inoculação fúngica

As amostras foram submetidas ao exame micotoxicológico prévio, avaliando-se a contamina-ção por AFs, ocratoxina A, zearalenona e fumonisina Bl. As amostras negativas foram utilizadas para o cultivo de fungo com o objetivo de avaliar o poten-cial de produção de AFs de cada híbrido.

A metodologia empregada para esterilizar o milho e inoculação fúngÍca foi adaptada da técnicapreconizada por PITI et ai. (1992). A esterilização dasuperfície dos grãos de milho foi realizada através da imersão das amostras em solução de hipoclorito de sódio a 0,4% por 2 minutos e, após, lavagem em águaestéril, empregando-se essa forma de esterilização para minimizar a interferência na composição do milho. A seguir, as amostras de 100 gramas de milhoforam acondicionadas em frascos Erlernmeyer de 250mf, aumentando-se a umidade das amostras demilho para 18% através da adição de águadeionizada. Os frascos foram fechados com tampasde algodão. A inoculação de esporos de Aspergillus parasiticus linhagem NRRL 2999 foirealizada através da adição de uma solução de TRITON X 1O0@ (MERCK S. A. Indústrias Quími-cas, Estrada dos Bandeirantes, 1099. Rio de Janeiro,RJ) a 0,5% em água. A padronização do inóculo foirealizada após o quinto dia de incubação do fungo.Contou-se o número de unidades formadoras decolônias (UFC/mf), utilizando-se o hemocitômetro deNeubauer. A seguir, ajustou-se o inóculo para 5 x100.000 UFC/mf, diluindo-se com o próprio meio decultivo, de acordo com a metodologia descrita por SHADOMY et ai. (1985). Inoculou-se aproximada-mente 650.000 esporos para amostras de 100 gramas de milho.

O delineamento experimental foi de blo-cos ao acaso com três repetições para cada híbrido,nos períodos de 5 e 10 dias de incubação, totalizando30 tratamentos. Os dados foram avaliados esta-tisticamente, empregando-se o teste Tukey (p<0,5).

 

Produção e quantificação das aflatoxinas

Os cultivos para a produção das AFs fo-ram incubados em estufa BOD com temperatura constante de 25°C por períodos de 5 e 10 dias.

A extração das AFs produzidas e quantifi-cação por Cromatografia de Camada Delgada foramrealizadas conforme a metodologia preconizada porSOARES (1987). O limite de quantificação dessemétodo foi de 1/1g!kg, 1O/1g!kg e 50/1g/kg paraAFs, ocratoxina A e zearalenona, respectivamente. Jápara fumonisina BI> empregou-se a metodologia preconizada por BINKERD et ai. (1993), com limite de quantificação de 10 Jlg!kg.

 

Na tabela 1, pode-se observar que 38% domilho recém-colhido apresentou ação degenerativa,compreendendo os grãos DI (26,7%) e DF (11,3%).O efeito grãos DI foi estatisticamente superior aos grãos DF em todos os híbridos, porém, dentro dos grupos não houve diferença significativa. Pode-se observar ainda que a porcentagem de milho DF é bastante alta, superior ao limite máximo tolerado pelas agroindústrias, que é de 6%. Isso ocorreu pro-vavelmente em função do milho ter permanecido na lavoura além do tempo ideal para colheita.

Apesar de encontrar alta incidência de fungos no milho recém-colhido (tabela 2) e umidade média de 18%, não foram detectadas micotoxinas. Isso pode ser atribuído ao curto espaço de tempo para a formação das mesmas, ou número reduzido de linhagens fúngicas com potencial toxigênico. Não foi constatada diferença significativa com relação à incidência de fungos nos diferentes híbridos. Porém, a contaminação por Fusarium sp. nos híbridos de milho recém-colhidos foi significativamente superior aos gêneros Aspergillus sp. e Penicillium sp. Na avaliação da microbiota fúngica, observouse ainda que nem todas as amostras apresentaram contaminação fúngica e outras apresentaram contaminação dupla ou até tripla.

A quantidade de fungos contaminantes encon-trados no milho recém-colhido foi menor que a contaminação encontrada por ORSI et ai (1995), porém a proporcionali-dade dos três gêneros foi idên

tica. Já ASEVÊDO et ai. (1994), ao avaliarem aincidência de fungos em milho estocado, encontraram com maior freqüência o gênero Aspergillus (72,2%), seguido pelo Penicillium (67,7%) e Fusarium (62,2%), diferindo das proporcionalidadesnormalmente encontradas no milho recém-colhido.

Nas tabelas 3 e 4, podem ser observados

os resultados da produção de AFs após cultivo deAspergillus parasiticus linhagem NRRL 2999, emcinco híbridos de milho. Esse fungo mostrou-se grande produtor de AFs no milho, especialmenteAFG,. No entanto, SHOTWEL et ai. (1966), culti-vando a mesma linhagem em arroz, obtiveram altaprodução de AFBl'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' Houve diferença significativa deAFs produzidas pelos diferentes híbridos somentequanto à produção de AFG2 em cultivos de 5 dias. Deacordo com as constatações de ZERINGUE et ai. (1996), pode-se estimar que os híbridos analisadospossuem níveis de ácido linoleico e produção delipoxigenase similares, propiciando condições se-melhantes aos Aspergillus sp. para a produção de AFs.

Constatou-se, também, que houve dife-rença significativa com relação ao consumo de maté-ria seca do milho somente nos diferentes períodos de cultivos fúngicos, com médias de 1,25 e 2,69%em cultivos de com 5 e 10 dias, respectivamente (tabela 5).

 

Dos híbridos avaliados, 62,0% dos grãos apresentaram-se íntegros, 26,7% danificados por insetos e 11,3% danificados pelo desenvolvimento fúngico. Não houve diferença significativa entre os cinco híbridos avaliados, tanto no grupo danificados por insetos ou danificados pelo desenvolvimento fúngico. Os híbridos estavam contaminados por Fusarium sp. 57,1 %; Aspergillus sp. 23,6% e Peni-cillium sp. 14,3%. Não houve diferença significativa entre os híbridos avaliados em relação à incidência dos três gêneros fúngicos, bem como esses não apre-sentaram níveis detectáveis de aflatoxinas, zearale

nona, ocratoxina A e fumonisina B 1. Os híbridos avaliados apresentaram diferença significativa quanto ao potencial de produzir aflatoxinas somente de aflatoxina G2 em cultivos de Aspergillus parasiticus por 5 dias. O crescimento fúngico no milho implicou a diminuição da matéria seca do milho, sendo de 1,25 e 2,69% em cultivos de Aspergillus parasiticus por períodos de 5 e 10 dias, respectivamente.

ANOERSON, H.W., NEHRING, E. W., WICHSER, N, Aflatoxincontamination of com in the field. loumal or Agricultural FoodChemistry, Washington, USA, v. 23, p. 775-782,1975.

ASEVÊOO, LG., GAMBALE, W., CORRÊA, B., et ai.Mycoflora and aflatoxigenic species of Aspergillus sppisolated from stored maize. Revista de Microbiologia, SãoPaulo, v. 25, n. I p.46-50, 1994.

BINKERO, K.A., SCOTT, O.H., EVERSON, R.l. et ai. Fumonisin contamination of the 1991 Indiana com crop and its effects on horses.Joumal Veterinary Diagnostic Investigation, Lawrence, USA, v. 5 p.653-655, 1993.

CORRÊA, B. Fungos toxigênicos em grãos e rações: biologia, ocorrência econtrole. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE MICOTOXINASE MICOTOXICOSES EM AVES. 1995, Curitiba, PR. Anais... Curitiba,FACTA: Fundação de Apoio à Ciência e Tecnologia Avícolas,1995.332 p. p. 15-20.

CRUZ, L.C.H., Características gerais das micotoxinas e micoto-xicoses. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE MICOTOXINAS E MICOTOXICOSES EM AVES, 1995, Curitiba, PR. Anais,.. Curitiba, FACTA: Fundação de Apoio à Ciência e Tecnologia Avfcolas, 1995.332 p. p. 1-13.

FENNELL, 0.1., LlLLEH01, E.B., KWOLEK, W.F. Aspergíllus flavus and other fungi associated with insect damaged field com. Cereal Chemistry. SI. Paul, USA, v. 52, p. 314-321, 1975.

JONES, F.T., HAGLER, W.H., HAMILTON, P.B. Association of lowleveis of aflatoxin in feed with productivity losses in comercial broileroperations. Poultry Science, Savoy, USA, v. 61,p. 861-868,1982.

LEESON, S., GONZALO, 1.0.G" SUMMERS, 1.0. Poultry disorders and mycotoxins. Ontário, Canadá: Guelph, 1995, 350p.

LILLEH01, E.B., FENNELL, 0.1., HESSELTlNE, C.W. Asper-gíllus flavus infection and aflatoxin production in mixtures of high-moisture and dry maize. Journal or Stored Products Research, v. 12, p. 11-18, 1976.

ORSI, R.8., CORRÊA, 8., POZZI, C.R" et ai. Microbiota fúngica em três hfbridos de milho recém colhidos e armazenados. In: 111 SEMINÁRIO SOBRE A CULTURA DO MILHO "SAFRINHA", Assis, SP. 1995. Anais... Assis: Instituto Ago-nômico de São Paulo, 1995. p. 105-110.

 

ORGANISACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Critérios de salud ambiental 11: Micotoxinas. Cidade de México: OSP, 1983.131 p.

 

PITT, 1.1., HOCKING, A.O., SAMSON, R.A. Recommended methods for mycological examination of foods. In: SAMSON, R. A., HOCKING, A. O., PITT, 1. I. et ai. Modem methods in food mycology. Amsterdam: Centraalbureau voor Schimmelcultures, 1992. Capo 3, p. 31''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''5-368.

REDDY, C.V. Aflatoxins in feed: an enemy to poultry producers in the tropics. World Poultry, Ooetichen, Netherland, v, 8, p. 19-20, 1992.

 

SALGADO, I.M., CARVALHO, P.C.T. Fungos toxigênicosassociados a cereais. Levantamento da micoflora associada amilho, trigo e arroz. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. li,p. 60-63, 1980.

SAMSON, R.A., HOEKSTRA, E.S., FRISV AO, J.c. Introductionto food-Bome fungi. 5. ed. Netherlands: Centraalbureau voorSchimmelcultures, 1996. 322 p.

 

 

SHADOMY, S., ESPINEL-INGROFF, A., CARTWRIGHT, R. Laboratory studies with antifungal agents: susceptibility tests and biossays. In: LENNETE, E.H., BALLOWS, A., HA VSLER, 1r. W.J., et ai. Ed. Manual of cIinical Microbiology, 4. ed. Washington: American Societty of Microbiology, 1995. Capo 5, p. 991-999.

SHOTWELL, O.L., HESSELTINE, C.W., STUBLEFIELD, R.D., et ai. Production of aflatoxin on rice. Applied Microbiology, Michigan, USA, V. 14, n. 3, p. 425-428, 1966.

 

SOARES, L.M.V. Micotoxinas: Um método para análise simultânea e incidência em alimentos comercializados na região de Campinas. Campinas, São Paulo: Unicamp, 1997. I 29p. Tese (Doutorado em Engenharia de Alimentos) - Facul-dade de Engenharia de Alimentos e Agrícola, Universidade Estadual de Campinas, 1987.

ZERINGUE, H.J., BROWN, R.L., NEUCERE, 1.N., et ai. Relationships between Có-C''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''2 alkanal and alkenal volatile contents and resistance of maize genotypes to Aspergillus flavus and aflatoxin prodution. loumal of Agricultural Food Chemistry, Washington, USA, v. 44, p. 403-407,1996.