Efeitos da interação entre aflatoxicoses e doença infecciosa bursal sobre níveis de enzimas de função hepática, colesterol e triglicerídeos em frangos de corte

INTRODUÇÃO

A criação intensiva de frangos de corte busca o pico de produtividade em condições máximas de desenvolvimento genético e manejo. No entanto, surgem diversos desafios expondo os lotes a quedas na produção. Estes desafios podem estar relacionados simplesmente a aspectos de manejo técnico ou podem ser de ordem tóxica ou infecciosa.

Após ingeridas, as aflatoxinas são absorvidas no trato gastrintestinal e biotransformadas primariamente no fígado, o qual é órgão alvo da aflatoxicose nas aves. Os animais acometidos sofrem importantes alterações no metabolismo hepático afetando o metabolismo das gorduras (TUNG et al., 1972).

De acordo com Bernardino (2000) e Van Den Berg (2000), a doença infecciosa bursal (DIB), também conhecida como doença de Gumboro, provocada por um agente viral, é considerada uma das principais enfermidades infecciosas em aves, causando prejuízos intensos, particularmente em sua forma subclínica. Embora tenha como alvo principal a bursa de Fabrício, podem ocorrer alterações em outros órgãos, tais como baço, timo, rim e fígado (LEY et al., 1983).

Triglicerídeos e colesterol são componentes analisados nos testes de avaliação do metabolismo lipídico. O lipídeo padrão do organismo é o triglicerídeo, que constitui, em média, 95% de toda a gordura que existe no corpo. O colesterol é constituinte fundamental na estrutura das membranas celulares, síntese de ácidos biliares e hormônios esteroides (RIEGEL, 1996).

Na medida em que o organismo está processando uma certa quantidade de gordura que tomou como alimento, os triglicerídeos ingeridos são hidrolisados e organizados em unidades lipoproteicas denominadas quilomicras (QM), sendo desta forma absorvidos pelo sistema linfático tendo assim acesso ao plasma. Além disso, a síntese de gorduras (lipogênese) ocorre no tecido adiposo e fígado, que são os tecidos lipogênicos que existem no organismo, sintetizando triglicerídeos que são secretados na corrente sanguínea para a utilização em outros tecidos (RIEGEL, 1996; MARZZOCO; TORRES, 1999).

Porém, nas aves, a lipogênese ocorre apenas no fígado; o tecido adiposo funciona apenas como reservatório lipídico (O’HEA; LEVEILLE, 1969; TUNG et al., 1972; LEVEILLE et al., 1975). Desta forma, alterações nos processos enzimáticos que regulam a síntese hepática podem ocasionar distúrbios no metabolismo das gorduras.

Interações entre agentes tóxicos e infecciosos na avicultura industrial podem ser responsáveis por grandes perdas produtivas. Poucos estudos foram realizados avaliando os efeitos destas interações (GIAMBRONE et al., 1978; CHANG; HAMILTON, 1982; BORDIN, 1995).

Tendo em vista a importância do estudo das variáveis fisiopatológicas no contexto de doenças com disseminada ocorrência na avicultura em geral, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da interação entre a aflatoxicose subaguda e doença infecciosa bursal no metabolismo das gorduras em frangos de corte de criação industrial.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 800 frangos de corte, machos, linhagem comercial. Para cada grupo de 160 aves foram ministrados os seguintes tratamentos: grupo A (controle): aves sem receber vacinação para DIB, com ração isenta de aflatoxina e sem inoculação viral; grupo B: aves vacinadas para DIB no primeiro e décimo-segundo dia de vida, com ração isenta de aflatoxina e sem inoculação viral; grupo C : aves sem receber vacinação para DIB, com ração isenta de aflatoxina, desafiados com cepa de campo da DIB, ao 14° dia de vida; grupo D: aves sem receber vacinação, recebendo ração com 1,25 ppm de aflatoxinas do 1° ao 42° dia de vida, sem inoculação viral; grupo E: aves vacinadas para DIB no primeiro e décimo-segundo dia de vida, recebendo ração com 1,25 ppm de aflatoxinas do 1° ao 42° dia de vida, desafiadas com cepa de campo da DIB, ao 14° dia de vida.

As rações consideradas isentas de aflatoxinas foram analisadas previamente no Lamic¹.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, sendo utilizadas cinco repetições e 7 momentos (7, 14, 18, 21, 18, 35 e 42 dias de vida). Cada repetição era formada por um número variável de aves (unidades experimentais), conforme a idade das mesmas, devido à necessidade de obtenção de quantidade suficiente de soro para o processamento das análises.

Para tanto, eram realizados pools de amostras de soro para cada idade. Assim, aos sete dias de idade, foram usadas 10 aves por amostra, aos 14, cinco, aos 21 e 28 dias, três, e aos 35 e 42 dias, duas, totalizando 125 aves. A utilização de 160 aves para cada grupo experimental foi necessária considerando-se índices normais de mortalidade de frangos em criações industriais em até 4% (LANA, 2000).

Os frangos foram criados em galpão experimental dividido em boxes de acordo com o tratamento ministrado. Aqueles pertinentes aos grupos submetidos à inoculação viral foram transferidos para isoladores de pressão negativa (Isolador PN300® – LNF Comércio e Indústria) em infectório, no dia da inoculação (14 dias de vida), sendo mantidas neste local até o término do experimento, no 42° dia.

As aves receberam ração comercial de acordo com as exigências nutricionais por faixa etária (NRC, 1994) e água ad libitum. As rações comerciais foram previamente analisadas pelo Lamic, não sendo detectadas outras micotoxinas presentes.

As aflatoxinas utilizadas nas rações dos grupos experimentais foram produzidas no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Federal de Santa Maria no Lamic, segundo técnica de Shotwell et al. (1966) modificada por West et al. (1973). A incorporação à ração foi realizada em misturador de premix por 10 minutos. Após a mistura, as amostras de ração ficaram contendo 1,25 ppm de aflatoxinas (B₁=69,64%, B₂= 0,56%; G₁= 29,22% e G₂=0,48%) de acordo com resultados de análises realizadas no Lamic.

Para o desafio viral, foi utilizada uma amostra variante de vírus de campo isolada por Kondo (1998) e classificada pelo laboratório Simbios²², conforme técnica proposta por Jackwood & Jackwood (1994), como pertencente ao grupo molecular 15. A dose infectante (DIE₅₀) foi de 10^3,0 por ave, por via oral, baseando-se em diversos trabalhos que utilizaram doses que variam de DIE₅₀ de 10^2,0 a 10^4,0 (LUCIO; HITCHNER, 1980; SALAZAR et al., 1995).

A vacinação contra a DIB foi realizada com vacina comercial³, cepa intermediária, no primeiro e 12° dia de idade (via sub-cutânea e oral, respectivamente), por ser este o esquema vacinal utilizado na região.

As colheitas de sangue realizadas nos momentos mencionados foram realizadas por punção da veia ulnar, utilizando-se seringas e agulhas de calibre 25X7 descartáveis, acondicionando-se em frascos de vidro sem anticoagulante para a obtenção do soro.

Avaliou-se a função hepática das aves analisadas por meio de dosagem das enzimas de função hepática AST e GGT, as quais foram determinadas por método colorimétrico utilizando-se kit comercial⁴.

O metabolismo das gorduras foi avaliado por meio da dosagem de colesterol e triglicerídeos no soro, determinados pelo mesmo método, porém utilizando-se outra marca de kit comercial⁵. Os resultados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade (BANZATTO; KRONKA, 1995).

RESULTADOS

As alterações referentes aos níveis de triglicerídeos foram observadas aos 18, 21 e 28 dias de idade (4; 7 e 14 dias após o desafio viral), não apresentando variações antes ou após este período (Tab.1).

TABELA 1 – Níveis de triglicerídeos (mg/dL) no soro de aves controle (grupo A), intoxicadas com aflatoxina (grupo B), somente vacinadas (grupo C), somente desafiadas com vírus (grupo D) e na interação entre desafio, vacinação e aflatoxina (grupo E). Valores entre parênteses indicam a variabilidade dos níveis encontrados.

Efeitos da interação entre aflatoxicoses e doença infecciosa bursal sobre níveis de enzimas de função hepática, colesterol e triglicerídeos em frangos de corte - Image 1

Aos 18 dias de idade, o grupo E apresentou níveis de triglicerídeos superiores aos grupos A, B e C (controle, intoxicadas por aflatoxinas e somente vacinadas, respectivamente), não apresentando, contudo, diferenças em relação ao grupo D (somente desafiado), o qual por sua vez não revelou diferenças em relação ao grupo B, indicando que tanto a aflatoxicose como o desafio viral interferiram no metabolismo dos triglicerídeos.

Aos 21 dias, observou-se provável efeito sinérgico entre aflatoxicoses, vacinação e desafio viral, detectando-se no grupo E níveis de triglicerídeos superiores a todos os grupos; porém aos 28 dias de idade, verificou-se que somente o grupo B apresentou níveis superiores ao controle, não havendo diferenças entre este e os demais grupos. Como não houve diferenças entre o grupo E o controle, verificou-se que somente o efeito da aflatoxina interferiu em relação a este parâmetro.

Em relação ao colesterol, observaram-se alterações aos 21, 28 e 35 dias de idade (Tab.2).

TABELA 2 – Níveis de colesterol (mg/dL) no soro de aves controle (grupo A), intoxicadas com aflatoxina (grupo B), somente vacinadas (grupo C), somente desafiadas com vírus (grupo D) e na interação entre desafio, vacinação e aflatoxina (grupo E). Valores entre parênteses indicam a variabilidade dos níveis encontrados.

Aos 21 dias de idade, ocorreu redução dos níveis séricos de colesterol nos grupos intoxicados (B e E) em comparação aos outros grupos; no entanto, como os grupos C e D (grupos somente vacinado e somente desafiado, respectivamente) não tiveram diferença significativa em relação ao controle, verificou-se que somente a aflatoxina possa ter influenciado neste parâmetro.

Aos 28 dias, novamente não houve diferença significativa entre o grupo controle e os grupos C e D, indicando que o efeito da vacinação ou do desafio viral não tiveram influência sobre este parâmetro também nesta idade, contudo observaram-se níveis reduzidos de colesterol nos grupos B e E em relação ao controle; sendo que, ainda, o grupo D e E não tiveram diferenças entre si; indicando desta forma, o efeito somente da aflatoxina.

Aos 35 dias de idade, verificou-se que o grupo B apresentou níveis inferiores somente ao grupo controle, não tendo diferenças em relação aos outros grupos; como os grupos C, D e E não tiveram diferenças em relação ao controle, é provável que somente as aflatoxinas tenham influenciado no metabolismo do colesterol nesta idade.

Em relação aos resultados das análises das enzimas de função hepática aspartato aminotransferse (AST) e gama glutamiltransferase (GGT), verificou-se que somente houve alterações aos 18 e 21 dias de idade, respectivamente aos 7 e 14 dias após o desafio viral (Tabela 3). Não foram observadas alterações em relação à enzima ALT entre os diferentes tratamentos.

TABELA 3 – Níveis de aspartato aminotransferase (AST) e gama glutamiltransferase (GGT) em U/I no soro de aves controle (grupo A), intoxicadas com aflatoxina (grupo B), somente vacinadas (grupo C), somente desafiadas com vírus (grupo D) e na interação entre desafio, vacinação e aflatoxina (grupo E) aos 18 e 21 dias de idade. Valores entre parênteses indicam a variabilidade dos níveis encontrados.

Aos 18 dias de idade observou-se que o grupo B (aflatoxinas) apresentou os níveis da enzima gama glutamiltransferase (GGT) superiores aos demais, contudo, sem diferenças significativas em relação aos grupos D e E, os quais, por sua vez não tiveram diferenças em suas médias em relação ao grupo controle. Verifica-se assim que, o vírus, a aflatoxicose ou a associação entre vírus, aflatoxicose e vacinação podem causar alterações nos níveis da enzima GGT, mas não a vacinação isoladamente.

Aos 21 dias verificou-se que os grupos B e E apresentaram níveis da enzima AST (aspartato aminotransferase) significativamente inferiores ao controle, porém sem diferenças em relação aos grupos C e D, os quais por sua vez não apresentaram diferenças em relação ao controle. Desta forma, observou-se que a aflatoxina foi responsável pela diminuição dos níveis de AST nesta idade.

DISCUSSÃO

O estudo dos mecanismos das ações tóxicas das aflatoxinas torna-se difícil pela diversidade de seus efeitos. Determinar que ação é crítica na citotoxicidade e quais efeitos são secundários é uma tarefa difícil; porém o fígado é considerado como principal órgão alvo (VIEIRA, 1995).

Diversas pesquisas ao longo dos anos analisaram o comportamento dos níveis de colesterol durante a aflatoxicose, concluindo que, mesmo em pequenas dosagens, a intoxicação por aflatoxina provocou uma redução desses níveis (MAURICE et al., 1983; HUFF et al., 1986; GIROIR et al., 1991; RAINA et al., 1991; MANI et al., 1993, SHUKLA; PACHAURI., 1995, SANTURIO et al., 1999; FRANCISCATO, 2006). Os resultados de nossas pesquisas aos 21, 28 e 35 dias concordaram com estes autores, observando-se hipocolesterolemia nestas idades e, ainda, aumento dos níveis da enzima AST aos 18 dias e redução dos níveis de AST aos 21 dias, evidenciando lesão hepática.

Na doença infecciosa bursal, embora possa ocorrer lesão hepática, a mesma foi considerada como transitória (LEY et al., 1983). No presente estudo, observou-se que o vírus ou a aflatoxicose podem ter causado aumento dos níveis da enzima GGT, a qual pressupõe a proliferação de ductos biliares, lesão típica de aflatoxicoses, porém o desafio viral não exerceu influência sobre os níveis séricos de colesterol, o que se opõe aos resultados encontrados na literatura, que por sua vez divergem entre sí. Ley et al. (1983) verificaram níveis reduzidos de colesterol no terceiro dia após o desafio viral, sugerindo consequência de lesão hepática; enquanto Panigrahy et al. (1986) e Saukas (1993) encontraram aumento dos níveis, cinco dias após o desafio, levantando a hipótese de hipoproteinemia pelo menor consumo de ração ou menor absorção de nutrientes.

A variação entre os resultados apresentados acima e os obtidos no presente estudo pode ser devido à variação antigênica das diferentes cepas virais utilizadas nos experimentos, pois os vírus de campo da doença infecciosa da bursa, pressionados com o grau de imunização, começaram a sofrer mutações (BERNARDINO, 2000). Desta forma, a patogenicidade pode variar de acordo com a cepa viral, o que se refletirá nas lesões, sinais clínicos e até mortalidade dos lotes. A cepa viral utilizada no presente experimento foi classificada como pertencente ao grupo molecular 15 (G15), tendo sido relatada por Lunge et al. (1997) e geralmente relacionada com casos subclínicos da doença, cuja patogenicidade depende do manejo adotado e de outros fatores associados (BERNARDINO, 2000).

Dentre os trabalhos pesquisados, os níveis séricos de triglicerídeos variaram: Giroir et al. (1991) e Panigrahy et al. (1986) não observaram alteração neste parâmetro em aves intoxicadas por aflatoxinas; enquanto Huff et al. (1986) e Santurio et al. (1999) encontraram níveis aumentados.

Na presente pesquisa, observaram-se alterações dos níveis de triglicerídeos aos 18, 21 e 28 dias de idade. Aos 18 dias de idade, verificou-se que tanto a aflatoxicose quanto o desafio viral provocaram aumento desses níveis; aos 21 dias, observou-se efeito sinérgico entre aflatoxicose, desafio viral e vacinação; porém aos 28 dias, verificou-se que somente o efeito da aflatoxina interferiu em relação a este parâmetro.

A hipertrigliceridemia observada, provocada tanto pela aflatoxicose como pelo desafio viral (4 dias após o desafio) como pela interação entre os agentes aos 21 dias (7 dias após o desafio), pode ser devido a uma possível diminuição do consumo de ração (não mensurada no presente experimento), pois de acordo com Marzzoco e Torres (1999), em condições de baixa ingestão calórica, há o estímulo para a degradação dos triglicerídeos que estão nos tecidos adiposos a fim de suprir a demanda energética dos tecidos, ocorrendo assim a hidrólise dos triglicerídeos com consequente liberação de ácidos graxos na corrente sanguínea e, por conseguinte, aumento de seus níveis, detectados pela dosagem sérica. Aos 28 dias, não mais se observou o efeito do vírus, provavelmente devido às condições experimentais de manejo controladas, não permitindo desta forma a exacerbação de seus efeitos.

CONCLUSÕES

O desafio viral não exerceu efeitos sobre os níveis de colesterol, porém refletiu-se em aumento dos níveis de triglicerídeos em associação com a aflatoxicose. A aflatoxicose, por sua vez, influenciou tanto nos níveis de colesterol como triglicerídeos nas aves analisadas.

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Esse artigo técnico foi originalmente publicado na revista Veterinária em foco, publicação científica da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), RS.

Efeitos da interação entre aflatoxicoses e doença infecciosa bursal sobre níveis de enzimas de função hepática, colesterol e triglicerídeos em frangos de corte

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