A importância dos marcadores de saúde intestinal para avaliação de probióticos

A saúde intestinal é um dos temas de maior relevância para a avicultura dos últimos anos. Diversos fatores estão envolvidos na saúde intestinal, sendo que os de maior destaque estão relacionados a microbiota, a nutrição e a resposta do hospedeiro (integridade intestinal e inflamação).

Entretanto, avaliar e predizer a saúde intestinal é muito complexo e, em muitas vezes, impreciso. Mesmo assim, marcadores intestinais são necessários para sua avaliação, e assim, (1) predizer problemas de performance, (2) avaliar a eficácia de estratégias para saúde intestinal, (3) justificar intervenções na produção e, (4) testar mudanças nutricionais e novas ferramentas de diagnóstico.

Diversos marcadores relacionados a saúde intestinal vêm sendo utilizados no campo para auxiliar na monitoria do status sanitário na avicultura; porém, a eficácia desses marcadores ainda é muito contestada, principalmente pela dificuldade em estabelecer critérios científicos e pelos problemas em estabelecer uma amostragem ideal e estatisticamente aceitável.  Ainda, alguns desses marcadores apresentam baixa correlação direta com os paramentos produtivos, o que coloca sua utilização questionável.

Entretanto, alguns marcadores vêm sendo exaustivamente testados e utilizados, proporcionado maior segurança aos usuários, principalmente pelo fato de terem um embasamento científico comprovado.  Dentre esses marcadores, os sistemas de escore macroscópicos através de necropsias, as análises histopatológicas e morfométricas, a análise da microbiota e metabólitos intestinais são metodologias que apresentam correlação positiva com o status de saúde intestinal das aves.

O objetivo desse artigo é revisar algumas metodologias de avaliação de saúde intestinal em aves e comentar sobre como temos comprovado os efeitos do probiótico Alterion^®, uma cepa exclusiva de Bacillus subtilis (29784), na modulação desses principais marcadores de saúde intestinal.

Em geral, a avaliação e classificação por meio de escores macroscópicos é realizada após a morte ou sacrifício de animais doentes; porém, na avicultura a realização de necropsias para fins de monitoria do status de saúde é comum e de extrema importância para o diagnóstico e controle de enfermidades. A aplicação de escores macroscópicos de lesões é feita durante a investigação necroscópica de uma ave, e hoje é classificada como a principal ferramenta de monitoria de saúde intestinal da avicultura.

Diversas metodologias de escore podem ser observadas no campo, entretanto, a metodologia publicada por Teirlynck e colaboradores (2011) mostrou ser de simples aplicação e fácil monitoria. Ainda, o sistema de escores de lesões macroscópicas apresentaram correlação negativa em relação ao comprimento de vilos e correlação positiva com o infiltrado de linfócitos T em situações de disbacteriose (Figura 1a e 1b).

Figura 1a. Correlação de escore macroscópico com comprimento de vilos e infiltrado de linfócitos T.

Figura 1b. Correlação de escore macroscópico com infiltrado de linfócitos T.

Utilizando a metodologia de Teirlync e colaboradores, realizamos um teste com desafio nutricional através da inclusão de 20% de centeio, induzindo aumento do conteúdo de PNA (polissacarídeos não amiláceos) das dietas, e então, avaliamos os efeitos do probiótico Alterion^® (Bacillus subtilis 29784). O escore de enterite bacteriana foi reduzido para 1.0 nos animais do grupo Alterion^®, sendo que os animais do grupo controle (apenas desafiado com PNA) mantiveram o escore 2.0 (Figura 2). Esse trabalho nos mostrou que foi possível verificar os efeitos do probiótico Alterion^® através de uma metodologia de avaliação de escores macroscópicos.

Figura 2: Alterion^® (Bs 29784) diminui escore macroscópico em frangos de corte desafiados com altos níveis de polissacarídeos não amiláceos (PNA).

Seguindo as análises macroscópicas, amostras de intestinos podem ser coletadas para avaliações microscópicas. Essas avaliações podem ser histomorfométricas, quando mensuramos estruturas intestinais como altura de vilos, espessura de criptas,  relação vilo/cripta; e histopatológicas onde avaliamos lesões no epitélio intestinal (mucosa e submucosa) e camadas adjacentes. Algumas metodologias foram desenvolvidas para facilitar uma avaliação histológica, aplicando sistemas de escores para diferentes parâmetros da mucosa intestinal, por exemplo: espessura da lâmina própria, espessura epitelial, proliferação de enterócitos, infiltrado de células imunes, proliferação de células de globet e presença de oocistos (Kraieski et al., 2017; Belote et al., 2018, 2019).

De fato, avaliações histomorfológicas do intestino podem auxiliar na avaliação da integridade epitelial e inflamação (Gholamiandehkordi et al., 2007). Ainda, alguns trabalhos associam o aumento da altura de vilos, espessura de lâmina própria e a quantidade de células epiteliais com maior peso corpóreo das aves (Kraieski et al., 2017). Em estudos realizados com o probiótico Alterion^®, observamos um aumento significativo do comprimento de vilos em relação ao grupo controle (sem aditivos para saúde intestinal) no íleo (controle = 0.66 µm; Alterion^® = 0.79 µm, P< 0.05) e no ceco (controle = 1.25 µm; Alterion^® = 1.46 µm, P< 0.05). A Tabela 1 resume os resultados encontrados (Jacquier et al., 2019).

Tabela 1: Morfologia de íleo e ceco em frangos de corte de 42 dias suplementados com Alterion^® (tabela adaptada de Jacquier et al., 2019).

Entretanto, sabemos que apenas análises morfométricas simples não são suficientes para avaliar o status de integridade do epitélio intestinal. Dessa maneira, acrescentar avaliações histológicas através de scores de diferentes parâmetros, auxiliam na análise da estrutura epitelial. De fato, com o uso da metodologia publicada por Kraieski et al. (2017), denominada ISI (I see inside), observamos que o probiótico Alterion^® diminui o escore ISI quando comparado com o grupo controle negativo (sem aditivos) e o grupo antibiótico (enramicina 10 ppm) em aves desafiadas em modelo experimental de enterite necrótica (Figura 3 e 4). Especificamente, podemos destacar a diminuição na espessura da lâmina própria e no epitélio da mucosa, e ainda a diminuição no infiltrado inflamatório nessas duas regiões (Figura 3 - Tirano et al., 2019). Esses dados reforçam o potencial do probiótico analisado em melhorar a integridade e modular a inflamação epitelial em situações com ou sem desafio.

Figura 3: Efeitos de Alterion^® sobre escore microscópico ISI em frangos de corte de 14 dias desafiados em modelo de enterite necrótica.

Figura 4: Alterion^® diminui o escore ISI em frangos de corte em desafio de enterite necrótica.

Legenda: Controle: Desafiado; Alterion: Desafiado + Alterion^®; Enramicina: Desafiado + Enramicina. O menor escore total observado no grupo que consumiu Alterion^® indica menor inflamação e estrutura da mucosa intestinal mais íntegra.

A análise da microbiota intestinal das aves ainda é classificada como uma ferramenta complexa e de pouco uso no dia a dia da indústria avícola. Entretanto, essa tecnologia vem se popularizando e, diversos trabalhos vem observando correlações importantes com saúde intestinal e índices zootécnicos. Avaliar a microbiota intestinal sob uma perspectiva ecológica poderia fornecer conhecimento em como promover a saúde através da nutrição, modulando comunidades microbianas específicas.

A microbiota pode ser classificada como resiliente quando a população microbiana apresenta maior diversidade e maior número de bactérias com propriedades anti-inflamatórias (bactérias produtoras de butirato como Ruminococcaceae e Lachnospiraceae) e menor número de patógenos oportunistas como Clostridium perfringens e Enterobacteriaceae como Salmonella e Escherichia coli. Diversos estudos vêm mostrando os benefícios da expansão de Firmicutes ou aumento da razão Firmicutes/Bacteroidetes. Dentro dos Firmicutes produtores de butirato, a diminuição da população de Faecalibacterium prausnitzii se destaca, mostrando ser um importante marcador em situações patogênicas específicas. De fato, Faecalibacterium prausnitzii exibe propriedades anti-inflamatórias, em parte relacionada com a secreção de metabólitos que bloqueiam a ativação de fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) e a secreção de Interleucina 8 (IL-8) (Sokol et al. 2008).

Em um modelo de desafio de enterite necrótica, foi observada a capacidade do probiótico Alterion^® em aumentar a alpha diversidade da microbiota intestinal (índice de Chao e Shannon) quando comparado com as aves do grupo controle (sem aditivos). Também foi observado maior prevalência de Ruminococcaceae (P> 0.001 – Tabela 2) com a suplementação de Alterion^®, especificamente aumento da Faecalibacterium prausnitzii (+13.4%; P< 0.001). Como comentado, essa bactéria vem sendo correlacionada com parâmetros de saúde intestinal como comprimento de vilosidades e área de linfócitos CD3. Além disso, observamos um aumento na prevalência de bactérias do gênero Ruminococcus e Lachnoclostridium (Tabela 2), que são responsáveis pela quebra de PNA em ácidos graxos de cadeia curta, como o butirato (molécula importante na reepitelização e efeitos anti-inflamatórios).Em um outro experimento onde frangos de corte foram desafiados com C. perfringens, observamos que o número de E. coli no dia 21 e o número de C. perfringens no dia 28 de vida das aves forma reduzidos significantemente no grupo que consumiu o probiótico.  

Figura 5: Diversidade da microbiota em amostras de conteúdo cecal de frangos de corte suplementados com Alterion^® (adaptado de Keerqin et al., 2021).

Tabela 2: Efeitos do probiótico Alterion^® sobre a microbiota de ceco (tabela adaptada de Jacquier et al. 2019; Poultry Science 98:2548-54).

Legenda: Bactérias das famílias Lachnospiraceae e Ruminococcaceae estão relacionadas com a produção de butirato, molécula envolvida na modulação da inflamação intestinal e reepitelização. A diminuição do gênero Bacteroides, está relacionada com aumento da relação Firmicutes/Bacteroidetes (grupo controle=1.66; grupo Alterion^®=3.17) que vem sendo associada com aumento de peso de aves (Jacquier et al., 2019).

Finalmente, não podemos esquecer dos metabólitos microbianos, que também podem ser relacionados a saúde intestinal. Como citado anteriormente, bactérias da microbiota convertem complexos de carboidratos (como PNA), fibras e até mesmo proteínas em uma variedade de metabólitos que apresentam diversos efeitos na saúde dos animais. Um exemplo já comentado seria a metabolização de PNA resultando predominantemente na produção ácidos graxos de cadeia curta como butirato e propionato.

Outros metabólitos estão associados a integridade intestinal, como é o caso das hipoxantina, pantotenato e ácido nicotínico, que estão intimamente relacionados com controle de processos inflamatórios e restauração tecidual. O ácido nicotínico (niacina) ativa o receptor GPR109A (um tipo de receptor nicotínico) no epitélio intestinal, suprimindo a inflamação local (Singh et al., 2014).

Figura 6: O ácido nicotínico modula a inflamação no intestino de aves (adaptado de Singh et al. 2014; Immunity. 16; 40(1): 128–139).

Foi demonstrado que o ácido nicotínico aumenta a proliferação de enterócitos e a “cicatrização” epitelial em um modelo in vitro com células Caco-2. Ainda, observamos que a suplementação com o probiótico foi capaz de aumentar os níveis de ácido nicotínico no lúmen do íleo e jejuno de frangos de corte com 13 dias de vida (P < 0.01); revelando um dos mecanismos de ação do Alterion^® sobre a saúde intestinal de aves (Figura 7).

Figura 7: Teores de ácido nicotínico em íleo e jejuno de frangos de corte suplementados ou não com Alterion^®.

Inúmeras tecnologias moleculares vêm sendo desenvolvidas para apoiar o entendimento da saúde intestinal como metagenômica, metabolômica, metatranscriptoma, etc; sendo essas, atualmente parte da linha de pesquisa de inúmeras grupos de pesquisas e empresas da área de avicultura; porém, em função da complexibilidade do intestino das aves, a replicação dessas metodologias na realidade de campo é um grande desafio dos profissionais da avicultura.

Em resumo, esse artigo revisou alguns dos importantes marcadores de saúde intestinal em aves, que podem ser utilizados tanto de maneira acadêmica como em aplicações práticas no campo. Avaliar os efeitos de um aditivo nutricional sobre a saúde intestinal requer o uso de diversas ferramentas e marcadores, sendo que apenas um fator parece não ser suficiente para avaliar o status de saúde intestinal de uma ave. Como podemos acompanhar, diversos marcadores já podem nos guiar em diversas estratégias de monitoramento de integridade intestinal e até mesmo na avaliação de produtos probióticos. De maneira reveladora, demonstramos que todos esses marcadores puderam ser utilizados para avaliar e comprovar a consistência do probiótico Alterion^® como ferramenta de fortalecimento da integridade intestinal, modulação (ou controle) da inflamação e modulação da microbiota.