Probiótico Lactobacillus Salmonella frangos

A produção avícola tem crescido consideravelmente na última década. Com esse aumento também surgiram preocupações quanto à segurança alimentar e, conseqüentemente, legislações que regem a produção destes alimentos desde a granja até a indústria ficaram cada vez mais rígidas no controle de patógenos com características zoonóticas,como as salmonelas. Esta bactéria é responsável por causar toxinfecções alimentares em seres humanos relacionadas ao consumo de carne de frango e ovos contaminados (Rossi Júnior et al., 2009). De maneira especial, normalmente a comunidade médica apresenta maior preocupação quanto aos sorovares Enteritidis (SE) e Typhimurium (ST), no entanto, atualmente segundo dados apresentados por Back (comunicação pessoal) a sorotipagem de isolados de aves comerciais desde os anos de 2007 a 2010 apresentam redução no aparecimento destes sorovares em contrapartida com aumento de outros, como é o caso do sorovar Minnesota (SM). Isso sugere a necessidade de estudos para controle de outros sorovares alem de SE e ST.
Em adição, existe também uma preocupação da sociedade quanto ao desenvolvimento de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos utilizados em produção animal. Alguns países como, por exemplo, a Suécia em 1986, seguido pela União Européia em 1997, iniciaram o processo de eliminação de antibióticos da produção animal tendo como base o "Princípio de Precaução". Frente a isso, a procura por alternativas a utilização de antibióticos para o controle de patógenos, vêm ganhando interesse nas diversas áreas da produção animal (Connoly, 2001).
Dentre as alternativas testadas atualmente estão os probióticos que, segundo Fuller (1989), são suplementos alimentares compostos de microorganismos vivos que afetam o animal hospedeiro otimizando seu balanço intestinal microbiano. Puupponen-Pimiä et al. (2002), sugerem que a utilização de probióticos estimula a multiplicação de bactérias benéficas, ocasionando a redução da proliferação de bactérias potencialmente prejudiciais, reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro. Lactobacillus são os principais microorganismos utilizados como probioticos, provavelmente, devido a fazerem parte da microbiota intestinal normal das aves. Gabriel et al. (2006) descreveram que os Lactobacillus, assim como Streptococcus e alguns Coliformes podem ser encontrados no intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) onde o pH tende mais para a neutralidade. O ceco alberga uma grande quantidade de bactérias Gram positivas e negativas, como por exemplo, Bifidobacterium, Bacteroides, Streptococcus e Clostridium.
O presente trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de um probiótico à base de Lactobacillus, utilizado na água, no controle de Salmonella enterica enterica sorovar Minnesota.

Foram alojados 54 frangos de corte, do 1° ao 28° dias de idade, divididos em três tratamentos de 18 animais cada, em um delineamento experimental inteiramente casualizado, onde cada animal era uma repetição de acordo com o descrito na Tabela 1.

Tabela 1: Amostras experimentais com seus respectivos tratamentos

No dia de chegada, seis animais foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de forma asséptica do ceco, fígado e coração para pesquisa de Salmonella spp. e todas as aves apresentaram-se negativas. Os animais foram mantidos em temperatura ideal de conforto para as aves, com fornecimento de água e ração à vontade sendo alimentadas com ração balanceada com níveis iguais ou superiores ao recomendado pelo NRC (National Research Council, 1994). Aos 20 dias de idade, todos os animais (exceto o tratamento 1) foram inoculados com 1 mL de solução oral de Salmonella Minnesota (SM) na concentração 10⁸ UFC/mL.
O produto probiotico comercial utilizado foi o FloraMax B11^® (Vetanco) constituído de Lactobacillus bulgaricus, L. casei, L. cellobiosus, L. fermentum e L. helveticus, oferecido na água de bebida dos animais no 1º, 19º, 20º e 21º dia de vida das aves, numa proporção de 30 gramas do produto diluído em 5 litros de água destilada.
Foram realizados suabes de cloaca de todas as aves, 48h pós-inoculação (PI), sendo separadas em pools de 4 aves cada e posterior contagem de SM.
Aos 28 dias de vida das aves, 7 dias após a inoculação com SM, 18 aves por tratamento foram eutanasiadas e necropsiadas para a coleta de forma asséptica do papo e do ceco e posterior contagem de Salmonella (individual por cada animal), totalizando 18 análises por tratamento de ceco e 18 análises por tratamento de papo.
Para realização do procedimento de contagem de Salmonella os suabes de cloaca, o ceco e o papo foram diluídos em água peptonada 2% em proporção de 1:9. Retirou-se 1 mL da solução de água peptonada 2% que foi pipetado no tubo contendo 9 mL de água peptonada 0,1% e assim sucessivamente até a diluição 10^-2, 10^-3, posteriormente retirou-se 100 μL de cada diluição sendo plaqueado em triplicata em meio Ágar de xilose-lisina-desoxicolato (XLD), com uma alça de Drigalsky espalhou-se o líquido na placa. As placas foram incubadas em estufa regulada a 35°C por 24h e submetidas a posterior contagem das colônias típicas (adaptado de Desmidt et al., 1998).
A solução inicial de água peptonada 2% foi incubada à 35°C por 24h, em caso de não ter ocorrido crescimento de colônias típicas de Salmonella após 24h de incubação em alguma amostra, retirou-se 100 μL da solução inicial em água peptonada 2% e acrescentou-se em um tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis, incubou-se em estufa regulada a 42°C por 24h para confirmação. Quando uma amostra era negativa nas contagens diretas em meio XLD, mas era positiva após o processo utilizando meio seletivo, a amostra era considerada positiva na ordem de log 10 =1 para análise estatística. Os resultados das contagens de colônias foram expressos conforme os Procedimentos de Contagem de Colônia de acordo com a Normativa nº6 publicada em 26 de agosto de 2003 (BRASIL - MAPA).
As Contagens das colônias de Salmonella foram transformadas em Log10 para análise estatística e submetidas ao Teste-T (P≤0,05).

É importante salientar que nenhuma ave apresentou sinais clínicos relacionados à infecção experimental com SM. Os resultados do presente estudo estão demonstrados na Tabelas 2. Nos suabes de cloaca realizados 48h PI, não se identificou diferença significativa para e eliminação de SM, porém nas análises microbiológicas realizadas aos 7 dias PI pode-se observar redução significativa da presença de SM no papo e ceco nas aves que receberam o tratamento com probióticos à base de Lactobacillus em comparação com as aves do controle positivo, sendo essa redução de 56% e 51,1% respectivamente.

 Tabela 2. Contagem de colônias para Salmonella nos diferentes tratamentos (médias±desvio padrão)

 Estes resultados indicam que o probiótico foi capaz de reduzir a excreção de SM no papo e ceco dos animais. Patterson & Burkholder (2003) citam que a microorganismos como os Lactobacillus pode agir na inibição de patógenos através de mecanismos como a competição por sítios de ligação, competição por nutrientes, produção de compostos tóxicos, assim como a estimulação do sistema imunológico. Estes mecanismos podem ser chamados de antagonismo bacteriano, interferência bacteriana, efeitos de barreira, resistência à colonização e exclusão competitiva. Outro fator que deve ser levado em conta na ação destas bactérias na redução de patógenos intestinais é o efeito imunoregulatório dos probióticos no sistema imunológico das aves, que pode melhorar a resistência contra patógenos intestinais, como por exemplo, Eimeria acervulina (EA). Dalloul et al. (2003) encontrou um aumento de linfócitos intestinais intraepiteliais em aves suplementadas com probióticos à base de Lactobacillus em comparação com um grupo controle sem adição deste produto. Estes linfócitos exercem um papel importante na proteção da mucosa intestinal durante infecções e neste caso resultaram em redução da excreção do número de oocistos de EA.
Como no presente estudo, não foi avaliado a resposta imune, não se pode concluir com segurança se a redução na excreção de SM deveu-se a efeito direto de exclusão competitiva do probiótico com a bactéria ou ainda se é um efeito associado a imunomodulação provocada pelos Lactobacillus nas aves. Maiores estudos serão necessários para melhor determinar esse mecanismo de ação.

A utilização deste probióticos à base de Lactobacillus podem ser utilizados para redução da excreção de SM, e no controle desta infecção.

Brasil, Instrução Normativa nº 6 de 26 de Agosto de 2003. 2003. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Diário Oficial da União.

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