Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) expressa atividade de “quorum quenching”

“Quorum sensing” (QS) é um sistema de comunicação entre células bacterianas baseado na produção e na secreção de pequenas moléculas sinalizadoras chamadas autoindutores, que se acumulam no ambiente extracelular quando é atingida alta densidade de células bacterianas (Fuqua et al., 1994). Uma vez atingido um limiar de concentração intracelular de autoindutores,a molécula sinalizadora desencadeia a expressão sincronizada de múltiplos genes na população, regulando assim funções biológicas importantes, como a transferência de plasmídeos, motilidade,  agregação, luminescência, biossíntese de antibióticos e virulência (Swi­ et al., 2001; Waters e Bassler, 2005; Williams et al, 2007). Os autoindutores melhor caracterizados são as N-acil-homoserina lactonas (AHL), uma família de moléculas formadas por um anel de homoserina lactona (HSL) N-acilado com um grupamento graxo acil na posição alfa. Os mecanismos que levam à inativação do sistema de comunicação QS são geralmente chamados de “Quorum Quenching” (QQ) (Dong et al., 2001, 2007), embora alguns autores prefiram restringir o termo à degradação enzimática dos sinais da AHL (Kjelleberg et al., 2008). Um dos possíveis mecanismo de ação dos probióticos é através do QQ para bloquear a comunicação (isto é, o “quorum sensing”) entre bactérias patogênicas, evitando assim o seu crescimento, a formação de biofilmes e a expressão de virulência. Portanto, foi realizado um estudo in vitro para avaliar a atividade de QQ da cepa CECT 5940 do Bacillus amyloliquefaciens, que tem capacidade inerente de produzir uma ampla gama de metabólitos secundários que comprovadamente interagem com diferentes populações bacterianas.

Probiótico: Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®)
Biossensor: Chromobacterium violaceum CECT 5999
(CV026) (McClean et al., 1997)

A cepa selvagem da espécie Chromobacterium violaceum produz um pigmento violeta (violaceína) e sua produção é regulada via QS. A cepa utilizada no estudo foi um
mutante desta espécie que perdeu sua capacidade inerente de produzir o pigmento violeta e, por isso, é chamado de mutante branco (CV026). Entretanto, este mutante pode ser induzido a produzir violaceína através da aplicação de AHLs no meio de cultura.

- C6-HSL: N-hexanoil-L-homoserina lactona (Sigma-Aldrich 09926)
- C8-HSL: N-octanoil-L-homoserina lactona (Sigma-Aldrich 10940)

Estes compostos (indutores) foram preparados como soluções-mãe em água destilada estéril a uma concentração de 1 mg/mL para C6 e a 0,7 mg/mL para C8.

Crescimento de Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 com análogos: O Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 foi incubado de um dia para o outro a 30°C em meio LB (Luria Bertani) em frascos de 250 mL com 50 mL de meio de cultura. Este pré-inóculo foi utilizado para inocular um novo frasco com 25 mL de LB a fim de manter uma OD600 de aproximadamente 1,1. Os análogos de AHL (autoindutores), C6-HSL ou C8-HSL, foram adicionados ao meio de cultura a uma concentração final de 4 µg/mL e incubados a 30°C com  agitação. Foram coletadas amostras em diferentes intervalos: 0 (imediatamente após a adição do indutor) e em 1, 2, 4, 6 e 24 horas. As amostras coletadas foram individualmente centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos para remover detritos celulares. O sobrenadante foi recuperado após centrifugação.

Ensaio de Detecção:

As placas de ágar LB foram recobertas com 4 mL de LB a 0,8% contendo 1 mL da cultura do indicador C. violaceum em LB com 25 µg/mL de canamicina. As placas permaneceram em repouso até a solidificação do meio de cultura. Em placas com poços de 6 mm de diâmetro foram preparadas com ponteiras estéreis. Foram adicionados 50 µL das diferentes amostras em cada poço. As placas foram então incubadas a 30°C por 24 h para permitir o crescimento do microrganismo indicador.

Controles e Interpretação de Resultados:

Poços com halos violeta indicaram que o QS foi bem-sucedido e não houve QQ. Onde houve atividade de QQ nas amostras adicionadas aos diferentes poços, os halos eram opacos e incolores, embora o indutor estivesse presente. No ensaio de detecção, foram utilizados os controles descritos abaixo e a Tabela 1 detalha a cor esperada no teste e a nomenclatura utilizada nas placas (entre parênteses).

- Moléculas indutoras (C6 HSL ou C8 HSL). Espera-se que o halo seja violeta porque estes compostos são indutores de violaceína.

- Meio de cultura LB estéril (M). Halo opaco incolor, porque não há indução.

-  LB médio + probiótico (sem indutor). As culturas de probiótico são incubadas pelo mesmo número de horas que o probiótico teste com as amostras de moléculas dos indutores C6 ou C8 e utilizadas como controle para verificar se o probiótico produz compostos que estimulam a produção de violaceína, causando resultado falso negativo. Espera-se esses controles tenham halo opaco incolor. São rotulados com um “E”, seguido do tempo de incubação em horas (E x horas).

-  Moléculas indutoras (C6 HSL ou C8 HSL). Espera-se que o halo seja violeta porque estes compostos são indutores de violaceína.

-  Meio LB + C6 ou C8. Essas culturas são incubadas pelo mesmo número de horas que o probiótico teste com C6 ou C8 a fim de verificar a degradação do indutor ao longo do tempo na ausência do microrganismo. Espera-se que esses controles tenham halos violetas. São rotulados com um “M” seguido do tempo de incubação em horas (M x horas).

As amostras de teste (molécula de indutor + probiótico) são rotuladas apenas com o número de horas de incubação: 0, 1, 2, 4, 6, 24. Como o indutor está presente, espera-se que o halo seja violeta e a ausência deste pigmento indica que o QS foi bloqueado por um mecanismo de QQ.

O ensaio realizado permitiu a clara visualização (pela inibição da produção de violaceína) da capacidade de um composto bloquear a indução de QS.
Foram analisados os sobrenadantes do probiótico (B. amyloliquefaciens CECT 5940) cultivado na presença de indutores C6 em diferentes tempos de incubação.

Os poços com água (A), meio de cultura (M) ou meio de cultura apenas com Ecobiol® (E0-24 horas) não produziram pigmento (Figura 1). Isto era esperado, uma vez que esses poços não continham o indutor C6, e o Ecobiol® isoladamente não produz qualquer composto que estimule a produção de violaceína pelo biossensor C. violaceum. Quando o meio de cultura com o indutor C6 foi adicionado aos poços e incubado por 24 horas (M0-24), foi observado halo pigmentado em todos os poços (Figura 1). Isso sugere que o indutor C6 não se degrada ao longo do tempo, porque o halo de violaceína foi observado mesmo após 24 horas.

Em poços contendo meio de cultura com Ecobiol® e com o indutor C6 (0-24), o halo pigmentado foi observado nas primeiras 6 horas, demonstrando que o C6 estava presente e estimulou a produção de violaceína. No entanto, após 24 horas, o pigmento já não foi observado, indicando que o Ecobiol® impediu a produção de violaceína e, portanto, teve a atividade de QQ.