ESTUDO DOS EFEITOS DE UMA MISTURA DE ÓLEOS ESSENCIAIS E ÁCIDOS ORGANICOS COMO SANITIZANTE NA REDUÇÃO DE PATÓGENOS EM NINHOS DE AVES

A produção de ovos, na maioria das granjas de matrizes de frangos de corte é feita em ninhos, face ao elevado custo de implantação de um sistema de coleta de ovos em ninhos mecânicos disponíveis no mercado. Associa-se a este custo, uma menor aceitação pelas galinhas, com aumento da postura de ovos na cama. Ovos de cama requerem maior mão de obra e geram custos de coleta e limpeza, com menor eclodibilidade e pintos de qualidade inferior. Outro fator a ser considerado é a evolução das linhagens produtoras de pintos de um dia, que selecionadas geneticamente para a maior deposição de musculatura na região do peito, tem apresentado alguma dificuldade para subirem nos ninhos, demandando a uma diminuição da altura dos ninhos.

Assim, na produção de ovos para incubação, se busca práticas para melhorar a qualidade e manejo dos ninhos, e conseqüentemente, a presença de ovos livres de sujidades reduzindo-se a produção de ovos de cama. Tanto o manejo dos ninhos como as coletas diárias, contribuem para a obtenção de ovos limpos e com menor grau de contaminação. Uma das práticas empregadas na obtenção de ninhos de melhor qualidade é o uso de sanitizantes visando à menor contaminação dos ovos (DEMASI, 1991).

No Brasil, os ninhos são preparados com maravalha e cavacos de madeira ou cascas de arroz. O material de cama utilizado deve proporcionar conforto e higiene às aves, evitando-se a presença de contaminantes, microorganismos e materiais estranhos, de tal forma que evite lesões de coxim plantar, celulites e enterites (CONY, 2007).

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de uma mistura de óleos essenciais e ácidos não ionizáveis na redução de patógenos em ninhos de aves comparativamente a um controle e um produto comercial existente no mercado.

Aves de reprodução de modo geral recebem monitoramente e controle para garantir a qualidade dos ovos destinados a produção de pintos de 1 dia. A grande maioria dos ovos é estéril internamente com relação à contaminação microbiana. As contaminações em geral decorrem da exposição a sujidades ou fezes no primeiro contato já após a postura (SILVA et al , 1997; SEIBEL, 2005). Entretanto, as condições manejo inadequado e falta de sanitização dos ninhos, pode levar a produção de ovos de baixa qualidade com contaminação elevada na casca e grande contagem inicial de colônias (SOUZA-SOARES & SIEWERDT, 2005; CONY, 2007).

Bactérias e fungos são os principais microrganismos responsáveis pelas alterações físico/químicas observadas no ovo após a postura. Os principais patógenos associados na contaminação do ovo são Salmonella spp,; Staphylococcus, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes e Yersinia enterocolítica (STRINGHINI, 2008). Dentre os coliformes encontrados em ninhos, a E. coli representa 95% das bactérias sendo a mais conhecida. Ainda, pesquisas referem que ovos podem ser contaminados com diferentes espécies de enterobactérias, tais como Enterobacter spp. (3,3%), Klebsiella spp. (1,6%), Serratia spp. (1,6%), Proteuss pp. (2,2%), Pseudomonas spp. (1,1%), Acinetobacter spp. (0,5%), Alcaligenes spp. (0,5%) e 6,0 % de outras enterobactérias. (SOARES & MESA, 2009; ADESIYUN et al. 2006). Também os fungos, são apontados como microrganismos responsáveis pelas alterações físicas ou químicas observadas no ovo já após a postura (STRINGHINI et al., 2009). As contaminações decorrentes de fungos são principalmente das espécies e gêneros Penecillium, Sporotrichum, Mucor, Cladosporium e Alternaria (CARDOSO, et al., 2001).

Os óleos essenciais constituem-se em complexas misturas de substâncias voláteis, geralmente lipofílicas (SIMÕES & SPITZER, 1999), cujos componentes incluem hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, ácidos orgânicos fixos, em diferentes concentrações, nos quais, um composto farmacologicamente ativo é majoritário. A maior ou menor atividade biológica dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus constituintes químicos como citral, pineno, cineol, cariofileno, furanodieno, limoneno, eugenol, eucaliptol, carvacrol e outros. Estes constituintes são responsáveis pelas propriedades antissépticas, antibacterianas, antifúngicas e antiparasitárias (CRAVEIRO ET AL., 1981; SOUZA ET AL.; 2005). Estudos demonstram que aproximadamente de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35% têm atividade antibacteriana (BHAVANANI & BALLOW, 1992).

FUKAIAMA (2005) refere que a maioria dos fenóis age sobre a membrana celular bacteriana, dificultando sua divisão mitótica, causando desidratação nas células e impedindo a sobrevivência de bactérias patogênicas, apresentando grande efeito como agente antimicrobiano. Destes, os mais efetivos, são o carvacrol e timol que atuam em leveduras, fungos e microorganismos Gram (+) e Gram (-), com amplo espectro anti-bacteriano. O Timol tem uma estrutura bastante similar ao carvacrol diferindo apenas no grupo hidroxila com diferente localização no anel fenólico (ULTEE, et al 1999). O carvacrol e o timol agem contra os microorganismos através de uma ação lipofílica na membrana celular dispersando as cadeias de polipeptídeos que irão constituir a matriz da membrana celular (NOSTRO et al, 2004). Atuam provocando mudanças na permeabilidade e atividade da membrana celular das bactérias, alterações na atividade dos canais de cálcio, perturbando o equilíbrio iônico com perda de ions K+. Estes danos ao sistema enzimático dos microrganismos estão relacionados à produção de energia e síntese de componentes estruturais, dificultando a condução e transporte do ATP intracelular. (KNOWLES et al, 2005; NOSTRO et al, 2004).                

ROLLER (2003) em amplo estudo com Staphylococcus e Salmonellas, cita que o carvacrol tem mais eficiência nos estágios iniciais de formação da membrana celular, impedindo o crescimento e multiplicação das bactérias. Diminuindo o crescimento bacteriano faz com que as bactérias produtoras de toxinas usem a energia para se manterem viáveis, sobrando pouca ou nenhuma energia para a produção de toxinas, e ocasionalmente quando as toxinas são ativadas não existe ATP suficiente para exportar estas das células bacterianas, desta forma, inibem a produção de toxinas bacterianas (ULTEE 1999). O timol tem maior efeito inibidor sobre microorganismos em pH levemente ácido, sendo efetivo no pH 5.5 e menos efetivo no pH 6.5. Isto porque em pH ácido a molécula de timol não é dissociada, exercendo melhora a sua ação junto às proteínas hidrofóbicas. Neste pH o timol solubiliza melhor os lipídios e proteínas com ação sanitizante.

O uso de misturas de ácidos orgânicos e inorgânicos é comum como ferramenta auxiliar na digestão do filme proteico-lipídico em ninhos, controlando a proliferação bacteriana intestinal (RISLEY et al., 1991; AUMAITRE et al., 1995; GABERT et al., 1999). O uso de acidificantes em aves objetiva a ação antimicrobiana e fúngica, melhorando a eclosão, esses ácidos podem penetrar passivamente na célula microbiana, onde liberam prótons e ânions, o que resulta em redução do pH intracelular, inibindo a ação de enzimas e levando o microrganismo à morte. A ação antimicrobiana, entretanto, pode depender também do acúmulo de ânions no conteúdo intracelular (Russel, 1992).

O experimento foi realizado utilizando as instalações do laboratório da empresa GRASP®, no período de janeiro a abril de 2011. Foi utilizado como material de ninho a casca de arroz. Os ninhos foram fornecidos por uma granja produtora de pintos de um dia.

Avaliação e identificação da contaminação dos ninhos de casca de arroz.

Foram pesados 5 g dos ninhos coletados aleatoriamente e repassados para placas de Petri estéreis a fim de avaliar a concentração de microrganismos existentes e ou contaminantes dos ninhos. Em cada placa contendo amostra foi acrescido 45 ml de água peptonada estéril, equivalente a diluição 1:10. Após homogeneização, foram realizadas novas diluições: 1:100 e 1:1.000. Alíquotas de 500 µL de cada diluição foram coletadas e semeadas em placas contendo o ágar TSA (Tripticaseína de Soja) e placas contendo o ágar SDA (Sabouraud Dextrose) e depois incubadas por 24 horas a 37oC. Após este período foram realizadas análises de contagem de bactérias aeróbias. Para a análise de fungos, placas foram deixadas em temperatura ambiente por 5 a 7 dias, respectivamente. Para a análise de coliformes totais, alíquotas de 1.000 µL da diluição 1:10 foram coletadas e semeadas em placas contendo o ágar VRBA (Cristal Violeta Vermelho Neutro Bile) e incubadas a 37ºC por 24h. Após as amostras serem incubadas em estufa, foi realizada a contagem de colônias.

Avaliação da eficácia dos produtos frente a um controle.

Foram pesados 5 g de ninho de casca de arroz considerados positivos e distribuído de forma homogênea em placas de Petri estéreis. Os tratamentos foram distribuídos conforme descrito a seguir:

Os produtos foram dispersos de forma homogênea nas placas de Petri e acrescidos em cada placa de 45 ml de água peptonada estéril, equivalente a diluição 1:10 , sendo então realizada a diluição de 1:1.000. Alíquotas de 500 µL de cada diluição foram coletadas e semeadas em placas contendo o ágar TSA (Tripticaseína de Soja) e placas contendo o ágar SDA (Sabouraud Dextrose) e incubadas por 24 horas a 37oC para as análises de contagem bactérias aeróbias. Para a análise de fungos, as placas foram deixadas em temperatura ambiente por cinco a sete dias procedendo-se então a contagem. Para a análise de coliformes totais foi utilizado alíquotas de 1.000 µL da diluição 1:10 foi coletada e semeada em placas contendo o ágar VRBA (Cristal Violeta Vermelho Neutro Bile) e após incubadas a 37ºC por 24h.

Após incubação em estufa, realizou-se a contagem das colônias. As demais análises foram realizadas de acordo com o tempo de exposição do produto (24h, 72h, 120h e 168h). Os testes foram realizados seguindo as normas preconizadas pela Resolução Normativa nº. 62, de 26 de agosto de 2003 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Os resultados submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey à probabilidade de 0,05% pelo programa Statistix 9.

Após a constatação da efetiva contaminação dos ninhos de casca de arroz, aplicaram-se os testes com os diferentes tratamentos. Os resultados dos testes foram realizados pelas médias da diluição 1:1.000. As tabelas e gráficos a seguir demonstram os resultados encontrados para bactérias aeróbias, coliformes totais e colônias de fungos.

 c-1) Bactérias Aeróbias

A tabela 1 resume os resultados de contagem de colônias e poder de inibição da mistura de óleos essenciais e ácidos orgânicos sobre as bactérias aeróbias.

Tabela 1: Resultados das análises de contagem de Bactérias Aeróbias.

Observa-se que para a contagem de colônias de bactérias aeróbias, após 45 minutos já foram encontradas diferenças significativas (p< 0,05) entre o tratamento controle, produto comercial e mistura de óleos essenciais e ácidos orgânicos. A redução do crescimento bacteriano foi nitidamente superior com o mistura de óleos essenciais e ácidos orgânicos; ainda, constatou se que quanto maior o tempo de contato do produto com o ninho, menor é a formação de UFC, ou seja, menor a contaminação. Isso se deve ao fato dos óleos essenciais voláteis e ácidos orgânicos quando associados apresentarem um grande poder antibacteriano (BONATO et al , 2008) . O tempo para que o produto exerça a sua ação é fundamental para a conservação dos ovos, e à medida que este transcorre aumenta significativamente a contaminação. Segundo BRAUN & FEHLHABER (1995), o tempo de migração de uma bactéria da casca para o conteúdo depende da temperatura de armazenamento e do grau de contaminação, sendo que a 30oC foi de um dia e, a 7oC, somente após 14 dias. WANG & SLAVIK (1998) também verificaram que o intervalo de tempo entre uma contaminação bacteriana experimental na casca e seu isolamento no conteúdo dos ovos foi de, aproximadamente, três dias quando os mesmos foram armazenados a 15oC.

Figura 1 - Comparação dos tratamentos com o controle em relação às análises de bactérias aeróbicas.

c-2) Coliformes totais

Os resultados da contagem de coliformes totais estão demonstrados na tabela e figura 2. Observa-se que em relação ao controle e ao tratamento com o produto testemunha, a mistura de óleos essenciais e ácidos orgânicos (Vitasan) proporcionou uma inibição do crescimento de colônias, superior aos demais.

Tabela 2: Resultados quantitativos das análises de contagem de coliformes totais.

* Médias iguais, por isso não houve estatística.
** Colônias incontáveis.

Resultados de inibição de crescimento de enterobactérias com diferentes misturas de óleos essenciais tem sido constatado por pesquisadores. BORSOI, (2009) testou a mistura de ácidos orgânicos e óleos essenciais no controle de excreção fecal de Salmonella Enteritidis (SE), observou que a mistura foi eficaz na redução da excreção fecal (SE), quando os ácidos estão na forma não dissociada (não-ionizados) podem atravessar a membrana semipermeável do microorganismo por difusão passiva e atingir o citoplasma. Em contato com o pH mais alcalino do meio intracelular, o ácido se dissocia iberando íons de hidrogênio e reduzindo o pH interno das bactérias. Esta queda de pH provoca a desnaturação da enzima citoplasmática, interferindo nos sistemas de transporte de energia e desacoplando bombas de ATP (adenosina trifosfato), ocasiando a morte da célula bacteriana. Os óleos essenciais atuam sinergicamente com os ácidos orgânicos, aumentando a permeabilidade da membrana das bactérias para a entrada dos ácidos ( SOUZA et al 2005).

Figura 3: Comparação dos tratamentos com o controle em relação às análises de coliformes totais.

c-3) Colonias de Fungos

A observação dos resultados na tabela e figura 3 demonstra que o tratamento com Vitasan® é mais eficiente em relação ao controle e o tratamento com o produto comercial (testemunha), sendo que a partir de 24 horas não ocorria mais crescimento fúngico. Nota-se que com 24h, a mistura de óleos essenciais e ácidos não ionizáveis (Vitasan) inibiu significativamente o crescimento das colônias de fungos.

Tabela 4: Resultados dos fungos.

CLEFF (2008) cita que associações de princípios ativos de óleos essenciais têm um efeito sinérgico e positivo na inibição do crescimento de diferentes espécies de fungos. LIMA ET AL. (2006) observou a atividade antifúngica dos óleos essenciais frente a espécies de Candida, inibindo em 58% o crescimento das cepas estudadas. SANTOS ET AL. (2010), observaram uma atividade positiva dos óleos essenciais frente a fungos de diferentes espécies, comprovando estatisticamente a inibição do crescimento do halo em diferentes diluições dos óleos.

Figura 2 - Comparação dos tratamentos com o controle em relação às análises de fungos.

A inibição do crescimento fúngico nas condições do teste foi total a partir de 72h de tratamento. Resultados similares foram constatados por BONATO et al (2008) ao utilizando uma associação de uma mistura de ácidos orgânicos e extratos vegetais. Estes pesquisadores constataram também não ocorrer alterações na qualidade dos ovos quando do fornecimento dos produtos de forma isolada ou associada. Em ampla pesquisa SOLIMAN & BADEAA (2002) constaram a inibição do crescimento de várias cepas de fungos aos cinco e sete dias quando usaram diferentes misturas de óleos essenciais.

Nas condições em que foi desenvolvido o experimento, e mediante os resultados obtidos pode-se concluir que:

a) A mistura de óleos essenciais e ácidos orgânicos (Vitasan) foi eficaz na sanitização de ninhos de casca de arroz usados por poedeiras produtoras de ovos para a produção de pintos de 1 dia.

b) Os resultados demonstram efeitos positivos (p<0,05), reduzindo o número de colônias de bactérias aeróbicas, fungos e coliformes.

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