Formas de Uso das Enzimas e desenhos experimentais
O desenho experimental adequado para avaliação da eficácia técnica das enzimas ou complexos enzimáticos é determinada pela forma de utilização adotada para o produto. Há normalmente duas formas básicas de utilização, que seriam, o uso "on-top" (uso da enzima na formulação normal com expectativa de melhoria no desempenho) e o uso das valorizações nutricionais (valorizações dos nutrientes do ingrediente ou da dieta e/ou uso de uma matriz nutricional fixa para determinada inclusão/ espécie/fase).
Uso de enzimas "on-top" - Alguns pesquisadores, entre os quais, Bertechini & Brito (2008), destacam que a utilização de enzimas para frangos de corte e poedeiras comerciais com o conceito "on-top" (excetuando fitases, que geralmente não é o objetivo) normalmente apresenta resultado imprevisível por uma série de fatores, entre os quais se destacam: o desajuste de matrizes nutricionais dos ingredientes básicos na formulação, as margens de segurança praticadas pela indústria avícola, aliadas à limitação fisiológica das aves em fases específicas, para se melhorar a sua eficiência alimentar, pela melhoria no aproveitamento de nutrientes de uma dieta.
Aves em fases fisiológicas específicas, podem ser mais sensíveis ao uso de enzimas na condições "on-top". Da mesma forma uma determinada situação de déficit nutricional (energia, aminoácidos, vitaminas e minerais) bem diagnosticada pode ser foco interessante para esta prática do uso de enzimas. Exemplos poderiam ser fases pré-iniciais, onde aves de corte e de postura apresentam sabidamente, limitações no aproveitamento de nutrientes (produção endógenas de enzimas) e as exigências preconizadas contribuem para o uso em alto volume de ingredientes com eventuais componentes anti-nutritivos em maior proporção, como farelo de soja (PNA´s e fitato), um outra situação a ser avaliada seria o uso de amilase na fase de crescimento ou abate onde mesmo com trato digestório desenvolvido, estudos apontam uma lacuna na digestão de amido por parte de aves de corte. Pode-se citar, também, aves poedeiras em pico de produção com alta demanda nutricional e com baixa capacidade de consumo inerente à genética ou qualquer outro fator externo como altas temperaturas.
Por outro lado, apesar da utilização factível e racional em função do diagnóstico, a mensuração dos efeitos descritos nos exemplos acima apresentam certo grau de dificuldade em função da variabilidade das respostas nestas fases. Especificamente com frangos de corte nas fases pré-inicias (1-7 dias de idade ou 1-10 dias), a variação é relativamente alta e por conseqüência observar resultados consistentes com significância estatística é geralmente difícil.
Para avaliar a precisão dos experimentos, um parâmetro comumente utilizado pelos pesquisadores no Brasil tem sido o coeficiente de variação (CV, %), o qual expressa o desvio-padrão como porcentagem da média. O CV permite que comparações de uma mesma variável/medida/característica em diferentes experimentos (Sakomura & Rostagno 2007). Os autores apresentam ainda, uma revisão na qual os CV´s médios, em diversos ensaios científicos, para ganho de peso (GP) e conversão alimentar (CA), que nesta fase seriam de 4,59% e 4,62% respectivamente, bem superiores aos valores de 2,94% e 2,39% para as mesmas características no período total de criação. Ainda em relação ao CV, Mohallem et al. (2008), apresentam uma classificação do CV de acordo com seu valor, para as características mais importantes de desempenho e carcaça para frangos de corte sendo interessante fonte de consulta para pesquisadores.
Contrariamente à variação porcentual avaliada pelo CV nos experimentos, a melhoria no desempenho de frangos de corte descrita na literatura, com uso "on-top" dos mais variados grupos de enzimas e suas combinações dificilmente supera 2%, o que nestas condições, geralmente não possibilita mensuração estatística de tal diferença. Em ocasiões como estas o pesquisador pode usar ferramentas como aumentar o "n" experimental que é sem dúvida uma das mais eficientes armas para minimizar o erro experimental, outra possibilidade seria avaliar o lote até o final, com base na alta correlação entre desempenho pré-inicial e desempenho como o todo do lote, que em situação de menor influência do erro experimental (CV) a resposta poderia ocasionalmente ser mensurada ao final do ciclo. Em se tratando de produção de ovos, o CV ainda é maior, com média em torno de 7,16% (22 experimentos tabulados, segundo Sakomura & Rostagno, 2007). Com poedeiras, talvez a melhor alternativa seja, realmente uma boa uniformização das condições experimentais no período pré-experimental, assim como a condução e acompanhamento criterioso da avaliação, visando minimizar o erro experimental, para possibilitar detecção de menores diferenças porcentuais entre tratamentos avaliados.
Usar combinações de enzimas para melhorar aproveitamento de energia e aminoácidos no conceito "on-top" em rações milhp-farelo de soja é esperar muito em termos de ganho de peso e melhoria da eficiência alimentar para garantir a viabilidade e retorno econômico. Na maioria dos casos estar-se-ia admitindo que não há padronizado exigências nutricionais corretas de acordo com as fases e/ou a matriz dos principais macroingredientes não estaria ajustada ou é muito variável. Repetimos aqui o discurso inicial que pode haver fases estratégicas para este fim, porém em condições normais esperar, por exemplo, um incremento em 120 kcal/kg na energia metabolizável em cima do que se formulou, parece no mínimo exagero, principalmente em função das limitações fisiológicas das aves. Um exemplo claro dessa situação, é retratada em um estudo conduzido por Bertechini et al (2006) que suplementou rações frangos de corte contendo fitase com alfa-amilase em níveis crescentes (on-top) na fase final de criação (25-42 dias) e observou hipertrofia do fígado, pâncreas e aumento na deposição de gordura abdominal, sem no entanto observar efeitos positivos sobre o desempenho (ganho de peso e conversão alimentar).
Uso de enzimas com redução dos níveis nutricionais - O uso mais corriqueiro das enzimas na avicultura brasileira sem dúvida é realizado através da redução nos níveis nutricionais das dietas. Nutricionistas e técnicos que trabalham com formulação de rações desenvolveram as mais variadas formas de formulação nesse contexto, entre elas destaca-se o uso de matrizes nutricionais (para rações ou ingredientes) com valorização da composição em nutrientes e energia, principalmente. Esta prática é mais comum em função da viabilização econômica das formulações com a expectativa, no mínimo, da manutenção do desempenho, fato este que impactará diretamente na redução do custo com alimentação por unidade de ganho e consequentemente no custo final, além do fato de ser melhor mensurada, quando comparada o uso "on-top" como comentado anteriormente.
Com esta abordagem é de suma importância o uso de tratamentos que academicamente são relatados como "controle positivo - CP" e "controle negativo - CN", visando evidenciar com qual precisão está se medindo a resposta, avaliar a matriz nutricional usada para os alimentos e os níveis nutricionais praticados experimentalmente ou mesmo das granjas experimentais de médias e grandes integrações.
Normalmente em condições de deficiências marginais o efeito fisiológico básico nas aves é melhorar digestibilidade e aproveitamento dos nutrientes e da energia. Nesse contexto a utilização racional das enzimas potencializa tal situação. Como relatado anteriormente, dietas que atendam plenamente as necessidades nutricionais para máximo desempenho das aves dificultam a mensuração de respostas com expectativa de ganho extra, através das enzimas, dessa forma é imprescindível o uso dos controles positivos e negativos para se ter parâmetros de comparação da efetividade das enzimas.
Enquanto as respostas de melhoria de desempenho nos anos 90, em função do aumento nos níveis energéticos das rações eram praticamente lineares (ganho de peso e consumo de ração), nos dias atuais, a seleção e melhoramento genético para hiperfagia (alto consumo) associadas a altas taxas de ganho de tecido dificilmente possibilitam a obtenção de respostas lineares para ganho, talvez até, devido à não correção nos níveis aminoacídicos das rações. O resultado normalmente seria uma resposta com ajuste não-linear (geralmente exponencial) para ganho, com maior sensibilidade para conversão alimentar e/ou eficiência alimentar (Bertechini, 2007; Guevara 2004; Dozier et al., 2008).
Dessa forma, a avaliação da conversão alimentar passa a ser uma medida interessante para se avaliar a eficácia das enzimas, nestas situações. É importante ressaltar, que a conversão alimentar se trata da relação entre duas outras variáveis e nem sempre apresenta distribuição normal, fato este bastante questionado por estatísticos, mas ao mesmo tempo, retrata de forma técnica e econômica o resultado obtido e é tradicionalmente aceita nas publicações acadêmicas e referência na avicultura comercial.
O uso de controle negativo é de suma importância tanto para evidenciar que o padrão utilizado (CP) é o ideal em termos de desempenho, quanto para demonstrar que os níveis praticados podem ser excessivos ou mesmo a matriz nutricional dos ingredientes está desajustada. Há que se ter cuidado, no entanto, pois a reduções nos níveis nutricionais, quando se pesquisa carboidrases e proteases, por exemplo, as valorizações ou redução nos níveis nutricionais são da ordem de 1-2% no caso dos aminoácidos e de 2-3% para energia metabolizável, em função disso o uso de um pequeno número de repetições poderá mascarar uma falsa hipótese de uso de níveis nutricionais excessivos em função da não diferenciação entre o controle positivo e o negativo.
Quando se trata da combinação de enzimas o número de tratamentos tidos com controle tende aumentar de acordo com o que se propõe a mensurar e até mesmo do grau da resposta que se espera com a utilização da aditividade dos efeitos principalmente sobre energia e aminoácidos. Normalmente o efeito da fitase sobre fósforo e cálcio, dentro dos níveis básicos de suplementação estão padronizados e com pouca variação (redução em 0,10-0,13 e 0,10-0,15 pontos porcentuais para fósforo disponível e cálcio, respectivamente). Por outro lado a redução dos níveis energéticos das rações normalmente varia entre 80-150 Kcal, ao passo que as estimativas de melhoria na digestibilidade dos aminoácidos flutuam entre 2-5%. Neste intervalo (energia e aminoácidos digestíveis) diferentes CN´s são propostos em ensaios de desempenho visando cercar ao máximo a resposta relativa aos efeitos das enzimas em combinação (xilanase, amilase, protease, glucanase e fitase). Paralelamente ensaios metabólicos avaliando efeitos sobre ingredientes ou dietas são conduzidos para respaldar a resposta obtida in vivo sobre o desempenho das aves.
Após confirmação da importância dos controles (CP e CN) ao se avaliar enzimas em dietas com níveis nutricionais reduzidos (marginais), focamos para a importância do número de repetições a se utilizar. Convencionalmente as avaliações de desempenho utilizam no mínimo 4 repetições e dificilmente mais que 8 repetições por tratamento. O aumento no número de aves por repetição mostra-se interessante para redução na variação do acaso, no entanto, pode começar a limitar quando este número afeta a condução operacional do experimento.
Em frangos de corte, Potter (1972), relata que instalações com 50-60 aves por box (parcela) minimizaram as variações entre repetições, sendo que boxes maiores dificultam a condução da avaliação e a manutenção de condições uniformes no ambiente. Dessa forma, Euclydes & Rostagno (2002), concluem que o uso de 20-30 aves/box com número de repetições maiores que 8, seriam ideais para se conseguir minimizar o erro-padrão e por conseqüência evidenciar diferenças para características estatísticas de desempenho e carcaça sem prejuízos sob aspecto de condução operacional da avaliação.
O aumento no número de repetições nas avaliações com enzimas, em relação às avaliações que visam medir diferenças maiores que 2% entre as médias obtidas para cada tratamento. O aumento no número de repetições além de aumentar a possibilidade de detectar diferenças em um determinado cenário, é eficaz em reduzir o erro experimental e por conseqüência o CV. Essa nova realidade (aumentar o número de repetições) não surge apenas para se avaliar enzimas mas também, vários outros aditivos zootécnicos em todos grandes centros de pesquisa no Brasil.
Recentes Pesquisas com combinações das enzimas
Um grande volume de trabalhos foram e estão sendo conduzidos para avaliar os efeitos positivos da suplementação enzimática nas rações das aves. Mais recentemente, as avaliações se concentram em definir efeitos aditivos dos diferentes grupos de enzimas. Quando referimos a combinação de enzimas invariavelmente estamos falando do uso da fitase somado à outro (s) grupo (s) de enzima (s).
Com o aporte de vários artigos publicados nos últimos anos, o conhecimento sobre substratos alvos das enzimas, nas variadas fases de criação de um frango de corte ou poedeira comercial já está bem estabelecido. Considerando a produção de frangos de corte tem-se as exigências nutricionais reduzindo com a idade, porém o conteúdo energético das rações normalmente aumenta com a idade, principalmente visando melhorar a eficiência alimentar em fase que a ave normalmente apresenta o trato digestório bem desenvolvido e ao mesmo tempo mudança no perfil de nutrientes para a deposição tecidual (gasta-se mais energia para deposição de gordura que formação de tecido magro). Dessa forma temos redução o uso do farelo de soja e aumento do conteúdo de milho em função da idade, este fato gera diferentes cenários em termos de substrato, como já descrito em muitas outras ocasiões.
De fato se em na fase inicial estrategicamente ótimas possibilidades para uso de PNAses (xilanase, betaglucanase e galactosidase) e proteases. Outros estudos dão conta de certa ineficácia na digestão do amido na fase inicial comparado com a fase final, assim o uso de amilase, também poderia ser uma alternativa interessante. Por outro lado, reduz-se a quantidade de farelo de soja, aumenta-se milho e muitas vezes o volume de ingredientes ou subprodutos de origem animal aumenta (farinha de carne e ossos, farinha de penas, farinha de vísceras, etc...). Neste cenário, geralmente se tem uma situação interessante ao uso de amilases e proteases, principalmente. Não significa dizer que não se pode usar outros grupos enzimáticos e sim que a concentração do substrato será fundamental na resposta à suplementação enzimática. A variação (queda em função das fases) observada quanto à concentração de fitato ocorre, porém é baixa, visto que tanto o milho quanto o farelo de soja o contém.
Cowieson et al. (2006) avaliaram suplementação de fitase em combinação com um complexo contendo xilanase, amilase e protease em rações de frangos de corte sendo uma avaliação conduzina nos USA e outra na Australia (metodologia similares). Usou 3 grupos de CN´s (suplementados ou não com enzimas) onde reduziu a energia em relação ao CP em: CN1- 140 e 145 Kcal/kg ENAn; CN2- 88 e 100 Kcal/kg EMAn e CN3- 49 e 52 Kcal/kg EMAn nas fases inicial e final respectivamente, além de reduzir 0,13 e 0,12 pontos porcentuais para fósforo e cálcio e entre 1 e 2% no teor de aminoácidos. Os autores observaram efetividade da combinação das enzimas nas diversas reduções de nutrientes comparado com aves do grupo CP. Nesta avaliação a não diferenciação muitas vezes entre os CN´s em várias ocasiões para ganho de peso e conversão alimentar demonstra a dificuldade em comprovar ou validar pequenas diferenças entre os tratamentos com limitado número de repetições ou amostra de aves.
Barbosa et al. (2008) verificaram que a suplementação de fitase em combinação com um complexo contendo xilanase, amilase e protease em rações de frangos de corte melhorarm o aproveitamento da proteína, da energia e do fósforo, fato este que se traduziu em melhor desempenho, porém não foi totalmente suficiente para recuperar aves submetidas ao controle negativo (redução em 130 e 145 kcal/kg EMAn nas fases inicial e final, 0,13 e 0,12 pontos porcentuais para fósforo e cálcio) com a suplementação enzimática em relação ao grupo de aves do controle positivo.
Resultado semelhante, utilizando o mesmo contexto e grupo de enzimas foi obtido por Bonato et al. (2009), porém sem divugar a valorização energética utilizada. Chama atenção que não houve redução nos níveis aminoácidicos, fato normalmente utilizado em função do uso da protease.
Um estudo interessante, também abordando combinações enzimáticas foi realizado por Francesch & Geraert (2009) que avaliaram um complexo enzimático contendo fitase, xilanase e betaglucanase como principais enzimas. Os autores estudaram um CP 4 tratamentos CN (com ou sem enzimas), que corresponderam às seguintes reduções nos níveis nutricionais: 1 - -65 kcal/kg EMAn, -0,15 e 0,12 pontos porcentuais para fósforo e cálcio e 1,5% nos aminoácidos digestíveis; 2 - -85 kcal/kg EMAn, -0,15 e 0,12 pontos porcentuais para fósforo e cálcio e 3,0% nos aminoácidos digestíveis; 3 - -65 kcal/kg EMAn, -0,20 e 0,15 pontos porcentuais para fósforo e cálcio e 1,5% nos aminoácidos digestíveis 4- -85 kcal/kg EMAn, -0,20 e 0,15 pontos porcentuais para fósforo e cálcio e 3% nos aminoácidos digestíveis. A suplementação do complexo enzimático avaliado foi efetivo em melhorar o desempenho das aves, assim como proporcionou boa mineralização óssea em relação às aves submetidas aos tratamentos com redução nutricional sem suplementação enzimática. Curiosamente, como retratado anteriormente, houve uma grande dificuldade em se estabelecer uma lógica em função dos níveis nutricionais praticados, de acordo com as respostas observadas para o desempenho das aves nos grupos CN sem uso de enzima. Houve maior sensibilidade à reduções maiores de cálcio e fósfor disponível que efetivamente para energia e aminoácidos digestíveis.
Muitas vezes, há uma grande dificuldade em extrapolar resultados obtidos em ensaios metabólicos para avaliações de desempenho em nível experimental e mais ainda á campo com um número grande de aves. Há muitos produtos comerciais no mercado, cada um com suas especificidades e apelos, porém, como a indústria avícola usa em larga escala as fitases, o uso de outros grupos de enzimas normalmente se dá com valorizações modestas quando comparadas aos resultados apontados pela pesquisa. Muitos trabalhos indicam valorizações da ordem de 120-150 kcal/kg EMAn apontadas em pesquisas com PNAses, amilases ou proteases somadas à fitases em avaliações experimentais, mas que à campo retornam-se o uso de margens de segurança quanto a valorização, tanto por receio do resultado em condições amplificadas ou mesmo por deixar espaço a ser trabalhado frente a competitividade de outros produtos comerciais ou situações de mercado que exijam redução no custo da formulação.
Um fato interessante que se observa seria as matrizes nutricionais com contribuição extrafosfórica preconizadas por muitas fitases comerciais que sobrepõe resultados positivos de enzimas específicas pra tal finalidade (carboidrases e proteases). A maioria das fitases comerciais preconizam uma possibilidade de redução entre 30-50 Kcal/kg EMAn e entre 1 e 2% nos aminoácidos digestíveis. Não se questiona os resultados obtidos em nível experimental, porém a grande variação de condições em nível industrial conduz as fitases a um degrau a mais do que a sua finalidade básica, e como são produtos que estão há muito tempo ocupando tal espaço (produtos consagrados) é extremamente complicado e temeroso usar valorizações para outras enzimas ou complexos (xilanase, betaglucanase, amilase e protease) que tiveram estudos isolados ou sem a presença da fitase nas dietas, quando usadas neste novo momento em combinação.
Conclusiones
O espaço conquistado pelas fitases na nutrição avícola é sem dúvida inquestionável pela mais variadas visões. Novos estudos de biotecnologia apontam porém a possibilidade concreta de gerar atividade de fitase com termotolerância em milho transgênico já com resultados de pesquisa positivos neste sentido. Seria um novo horizonte para as enzimas?
A utilização de xilanase, betaglucanase, amilase ou protease (de forma individual ou em diferentes complexos) sempre em conjunto com a fitase constitui numa técnica eficiente em reduzir custo com alimentação por unidade de ganho, principalmente pelos ganhos energéticos obtidos na nutrição das aves, além de ser interessante em condições específicas com diagnóstico de deficiência energética, dificuldade de digestão ou limitação de consumo em função de causas externas ou da linha genética.
Com a tendência cada vez maior de grande variação no preço das commodities, otimizar o aproveitamento de nutrientes e da energia dos mesmos assim como a utilização de ingredientes alternativos visando explorar ao máximo os nutrientes atrelada ao uso de enzimas são conceitos estratégicos dentro da nutrição de aves em curto e médio prazo.
A mensuração de efeitos em condições de peletização de rações continua sendo um grande desafio da Pesquisa tanto Brasileira quanto Mundial, visto que a peletização é uma realidade nos grandes países produtores e tendência naqueles com grande potencial para a avicultura.
O investimento em pesquisa é sem dúvida o caminho a ser seguido visando sempre esclarecer desde respostas fáceis de desempenho que valide tal situação, mas também estudos aplicados avaliando-se substratos pré e pós-digeridos auxiliando na elucidação de respostas através dos efeitos fisiológicos. Quantificação precisa das enzimas quando diluídas em rações e de aminoácidos, não se restrinja apenas à iniciativa privada, mas também à Instituições Públicas de Ensino e Pesquisa.
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