Laringotraqueíte infecciosa: vigilância ativa e monitoria constante

A Laringotraqueíte Infecciosa das aves (LTI), na forma aguda, provoca dispneia severa, tosse, expectoração de exsudato muco-sanguinolento que pode levar à morte em dois a três dias. A forma subaguda caracteriza-se por sinusite, conjuntivite, traqueíte, estertores suaves e baixa mortalidade O vírus causador da doença é o Herpesvírus dos Galídeos tipo 1, membro da Família Herpesviridae. Não existe tratamento, sendo as medidas de biossegurança e vacinação os métodos recomendados para conter a disseminação da doença (CHACON & FERREIRA, 2009). Esta enfermidade é considerada como altamente contagiosa e deve ser obrigatoriamente notificada ao serviço oficial de defesa sanitária animal. Após o surto de LTI ocorrido em 2002, na região de Bastos, no Estado de São Paulo, vacinas atenuadas de origem de embrião de galinha (CO) ou de tecido celular (TCO) foram utilizadas para conter o surto inicial, tendo sido, em fases posteriores, substituídas por vacinas recombinantes, que não disseminam vírus vacinal no campo. Desde então a Coordenadoria de Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo vem executando uma programa extensivo de controle e monitoramento de todo o plantel de aves de postura comercial da região, pioneiro no Brasil, tendo realizada diversas etapas, mesclado por medidas de profilaxia inespecíficas e específicas, permeada por vigilâncias ativa e passiva. Este programa tem a cooperação técnica de especialistas do Poultry Diagnostics Research Center (PDRC) da Universidade da Geórgia (UGA), nos Estados Unidos (EUA), e também da Universidade de São Paulo e de Pesquisadores do Instituto Biológico. Na fase atual, um novo projeto está sendo realizado em conjunto com os pesquisadores do Instituto Biológico, que tem como objetivos: estudar a prevalência e caracterização molecular dos vírus de LTI circulantes no plantel de aves de postura comercial da região de Bastos, diferenciar estirpes de campo e de vírus vacinais, utilizando-se de procedimentos oficiais de monitoramento sanitário, caracterizar o status de proteção do plantel e o grau de desafio existente na região.

Em uma primeira etapa foram colhidos soros, suabes traqueais e fragmentos de órgãos (traquéia, laringe e conjuntiva ocular) de aves em diferentes fases de produção, provenientes de 48 propriedades da região de Bastos/SP, com idades variando de 15 a 95 semanas, durante o primeiro semestre de 2014. As técnicas empregadas para o diagnóstico foram o ELISA, PCR e o diagnóstico histopatológico (coloração hematoxilina e eosina). A amostragem foi composta por 15 aves de cada lote, sendo que para o histopatológico foram coletadas amostras de três aves e para a PCR, três pools composto por cinco suabes de traquéia. As PCRs convencionais foram realizadas para detectar um segmento parcial (688pb) do gene da proteína reguladora da transcrição de células infectadas (ICP4) do vírus da LTI.

Os resultados obtidos revelaram que dos 48 lotes avaliados, seis foram positivos na PCR (12,5 %), 23 positivos no teste de ELISA (47,9 %), com uma média geométrica de títulos variando entre 694 a 2.200 e seis lotes apresentaram alterações histopatológicas de discreta laringotraqueíte, sem corpúsculo de inclusão, de acordo com os dados apresentados no quadro abaixo:

Tabela 1: Resultados de testes diagnósticos obtidos por PCR, Histopatologia e ELISA

Os resultados indicam que existem vírus de baixa patogenicidade circulantes no plantel, apesar de não terem sido observados sinais clínicos de laringotraqueíte, bem como das lesões histopatológicas discretas e inespecíficas, que podem estar associadas ao vírus da LTI, ou a outros patógenos respiratórios. Este fato pode ser um indicativo da presença vírus vacinal, devido à utilização de vacinas vivas por um determinado período. Em uma segunda etapa do projeto, a ser executada no primeiro semestre de 2015, será realizada uma nova amostragem, na qual será analisada pela técnica de Real Time PCR. O diagnóstico molecular tem se tornado padrão na detecção e diferenciação de muitos patógenos, a PCR Real Time é um método diagnóstico bastante especifico e sensível, com múltiplas capacidades. Uma nova técnica baseada em uma restrição enzimática de fragmentos de DNA para identificar o polimorfismo entre amostras de vírus de laringotraqueíte infecciosa, denominada RFLP foi desenvolvida por Callisson et al. (2009), com o objetivo de detectar sítios polimórficos específicos que permitem diferenciar vírus de campo e amostras vacinais. Por esta técnica o DNA amplificado é digerido com enzimas de restrição que reconhecem as regiões alvo e o produto dessa restrição é utilizado como molde para uma segunda reação de Real Time PCR com primers flankeados. A análise da variação de valores de CT obtidos das duas reações de Real time PCR da amostra digerida e não digerida do DNA permite a genotipagem da amostra. Desta forma poderemos realizar a caracterização e diferenciação molecular dos vírus circulantes encontrados. Estes resultados, associados às avaliações clínica e histopatológica permitem verificar o grau de patogenicidade das amostras.

A execução de um Programa Sanitário de controle para se monitorar a aringotraqueíte no Bolsão de Bastos, exercido pela CDA é de fundamental importância para o controle desta enfermidade.

A diferenciação entre cepas de campo e de vacinas tornou-se necessária no acompanhamento desta enfermidade, sendo importante a realização de novas pesquisas. Métodos como a PCR seguida de RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição e o sequenciamento são ferramentas importantes que podem ser utilizadas para realizar a caracterização das cepas encontradas na região.

À Fundação de Ampaoa à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP – pelo suporte financeiro

A equipe de técnicos, funcionários e colaboradores da Cordenadoria de Defesa Agropecuária

CALLISON, S. A.; RIBLET, S. M.; RODRIGUEZ-ÀVILA, A.; GARCIA, M. Reverse restriction fragment length polimorphism (RRFLP): A novel technique for genotyping infectious laryngotracheitis virus (ILTV) live attenuated vaccines. Journal of Virological Methods. v.160, p. 119-124, 2009.

CHACÓN, J. L.; FERREIRA, A. J. P. Differentiation of field isolates and vaccine strains of infectious laryngotracheitis virus by DNA sequencing. Vaccine. v. 27, n. 6731-6738, 2009.