Pesquisas enzimas experimentais

A utilização de enzimas em dietas avícolas no Brasil, ganhou amplo espaço na última década, sendo explicada por vários motivos entre os quais podemos destacar alguns; - A eficácia técnica-econômica do uso de “fitases” quebrou paradigmas freqüentemente encontrados na implantação de uma nova ferramenta tecnológica, neste caso, o uso das enzimas e complexos enzimáticos. - A busca incessante por redução no custo por unidade de ganho na indústria avícola está intrinsecamente ligada à redução no custo com alimentação. - Variabilidade nos custos dos principais insumos/matérias-primas das dietas, e em alguns casos variação na composição nutricional. - Disponibilidade regional de ingredientes alternativos específicos que apresentam perfil nutricional (proteína/carboidrato/lipídeos) diferenciada em relação á dieta padrão nacional (milho-farelo de soja-farinha de carne e ossos). - Adoção da ferramenta tecnológica por parte dos técnicos da indústria avícola, acreditando e fomentando informações, creditando e validando os fatores e motivos descritos acima. Sob ponto de vista legislativo, no Brasil as enzimas se enquadram como aditivos zootécnicos, que por conceito, segundo o MAPA (IN 13, Anexo I, item 3.5.1.d) retrata aditivos zootécnicos como “toda substância utilizada para influir positivamente na melhoria do desempenho dos animais”. Ainda segundo o Anexo II da mesma “Instrução Normativa” que trata mais especificamente aos grupos de aditivos, pode enquadrar as enzima mais precisamente no item 4.a como “aditivo zootécnico digestivo” sendo definida como “substância que facilita a digestão dos alimentos ingeridos, atuando sobre determinadas matérias-primas destinadas à fabricação de produtos para alimentação animal. A legislação é clara, ou seja, para licenciamento de um produto comercial para esta finalidade, entre outras necessidades descritas na(s) Instrução (ões) Normativa (s) é primordial que se comprove eficácia técnica funcional da enzima ou complexo enzimático. Sob a ótica da acadêmica, apesar da incessante busca por respostas também deflagrada na última década pelos pesquisadores nacionais, várias respostas necessitam de respostas ou as respostas precisam de ajustes sobre o uso adequado das enzimas. O(s) “porquê(s)?”, “onde?” e “para quem?” já foram bastante explorados, mais ainda sim, às vezes, necessitam de esclarecimentos. Acredita-se no entanto, que os principais focos da pesquisa atual e por conseqüência, da utilização comercial seriam “como utilizar?” e talvez para espanto de alguns “quanto utilizar?”. “Como utilizar?” seria um questionamento de base técnica, por outro lado, “quanto usar” aborda tanto questões de ordem técnica, assim como econômica e financeira. Objetiva-se com a discussão que se segue, abordar algumas informações sobre desenhos experimentais que focam comprovar e validar a eficácia do uso de enzimas para aves que é objetivo primordial, inclusive das exigências da legislação vigente, associadas à apresentação de pesquisas recentes que apontam novos rumos ou mesmo que comprovem hipóteses levantadas que visam evidenciar mais claramente “como” e “quanto” utilizar as enzimas no contexto da avicultura industrial no Brasil, que é sem dúvida uma das mais desenvolvidas do mundo.

O desenho experimental adequado para avaliação da eficácia técnica das enzimas ou complexos enzimáticos é determinada pela forma de utilização adotada para o produto. Normalmente na pesquisa e o uso corriqueiro à campo no Brasil é caracterizado por duas formas básicas de utilização, que seriam, o uso “on-top” (uso da enzima na formulação normal com expectativa de melhoria no desempenho) e o uso das valorizações nutricionais (valorizações dos nutrientes do ingrediente ou uso de uma matriz nutricional fixa para determinada inclusão e espécie).

Alguns pesquisadores, entre os quais, Bertechini & Brito (2008), destacam que a utilização de enzimas para frangos de corte e poedeiras comerciais com o conceito “on-top” (excetuando fitases, que geralmente não proporciona resposta positiva com o uso on-top) normalmente apresenta resultado imprevisível por uma série de fatores, entre os quais se destacam: o desajuste de matrizes nutricionais dos ingredientes básicos na formulação, as margens de segurança praticadas pela indústria avícola, aliadas à limitação fisiológica das aves em fases específicas, para se melhorar a sua eficiência alimentar, pela melhoria no aproveitamento de nutrientes de uma dieta. Aves em fases fisiológicas específicas, podem ser mais sensíveis ao uso de enzimas na condições “on-top”. Da mesma forma uma determinada situação de déficit nutricional (energia, aminoácidos, vitaminas e minerais) bem diagnosticada pode ser foco interessante para esta prática do uso de enzimas. Exemplos poderiam ser fases pré-iniciais, onde aves de corte e de postura apresentam sabidamente, limitações no aproveitamento de nutrientes (produção endógenas de enzimas) e as exigências preconizadas contribuem para o uso em alto volume de ingredientes com eventuais componentes anti-nutritivos em maior proporção, como farelo de soja (PNA’s e fitato) e aves poedeiras em pico de produção com alta demanda nutricional e com baixa capacidade de consumo em função de altas temperaturas ou outro fator qual quer. Por outro lado, apesar da utilização factível e racional em função do diagnóstico, a mensuração dos efeitos descritos nos exemplos acima apresentam certo grau de dificuldade em função da variabilidade das respostas nestas fases. Especificamente com frangos de corte nas fases pré-inicias (1-7 dias de idade ou 1-10 dias), a variação é relativamente alta e por conseqüência observar resultados consistentes com significância torna-se geralmente complicado. Para avaliar a precisão dos experimentos, um parâmetro comumente utilizado pelos pesquisadores no Brasil tem sido o coeficiente de variação (CV, %), o qual expressa o desvio-padrão como porcentagem da média. O CV permite que comparações de uma mesma variável/medida/característica em diferentes experimentos (Sakomura & Rostagno 2007).

Os autores apresentam ainda, uma revisão na qual os CV’s médios, em diversos ensaios científicos, para ganho de peso (GP) e conversão alimentar (CA), que nesta fase seriam de 4,59% e 4,62% respectivamente, bem superiores aos valores de 2,94% e 2,39% para as mesmas características no período total de criação. Ainda em relação ao CV, Mohallem et al. (2007), apresentam uma classificação do CV de acordo com seu valor, para as características mais importantes de desempenho e carcaça para frangos de corte sendo importante fonte de consulta para pesquisadores. Geralmente, a obtenção de respostas com diferença estatística significante, teria que ser no mínimo igual ao porcentual do CV, ou seja, a diferença para conversão alimentar entre o grupo com uso de enzimas “on-top” e o grupo controle teria nestas condições, necessariamente que ser no mínimo 4,62% (p.ex.: considerando um valor padrão de CA até 10 dias de 1,119 a CA com enzimas teria que ser melhorada para 1,067). Contrariamente, a melhoria no desempenho de frangos de corte descrita na literatura, com uso “on-top” das enzimas dificilmente supera 2%, o que nestas condições geralmente não podem ser mensuradas. Em ocasiões como estas o pesquisador pode usar ferramentas como aumentar o “n” experimental que é sem dúvida uma das mais eficientes armas para minimizar o erro experimental, outra possibilidade seria avaliar o lote até o final, com base na alta correlação entre desempenho pré-inicial e desempenho como o todo do lote, que em situação de menor influência do erro experimental (CV) a resposta poderia ocasionalmente ser mensurada ao final do ciclo. Em se tratando de produção de ovos, o CV ainda é maior, com média em torno de 7,16% (22 experimentos tabulados, segundo Sakomura & Rostagno, 2007). Com poedeiras, talvez a melhor alternativa seja, realmente uma boa uniformização das condições experimentais no período préexperimental, assim como a condução e acompanhamento criterioso da avaliação, visando minimizar o erro experimental, para possibilitar detecção de menores diferenças porcentuais entre tratamentos avaliados.

O uso mais corriqueiro das enzimas na avicultura nacional sem dúvida é realizado através da redução nos níveis nutricionais das dietas. Esta prática é mais comum em função da viabilização econômica das formulações com a expectativa, no mínimo, da manutenção do desempenho, fato este que impactará diretamente na redução do custo com alimentação por unidade de ganho e consequentemente no custo final, além do fato de ser melhor mensurada, quando comparada o uso “on-top” como comentado anteriormente. Os pesquisadores e a indústria avícola nacional tem utilizado desta forma de abordagem com bastante criatividade, no entanto, algumas respostas podem levar à interpretações equivocadas, quando extrapoladas para a população total. Com esta abordagem é de suma importância o uso de tratamentos que academicamente são relatados como “controle positivo - CP” e “controle negativo - CN”, visando evidenciar com qual precisão está se medindo a resposta, ou mesmo, avaliar a matriz nutricional usada para os alimentos e os níveis nutricionais praticados experimentalmente ou mesmo das granjas experimentais de médias e grandes integrações. Como relatado anteriormente, dietas que atendam plenamente as necessidades nutricionais para máximo desempenho das aves dificultam a mensuração de respostas com o uso de enzimas, dessa forma é imprescindível o uso dos controles positivos e negativos para se ter parâmetros de comparação da efetividade das enzimas. Enquanto as respostas de melhoria de desempenho nos anos 90, em função do aumento nos níveis energéticos das rações eram praticamente lineares, nos dias atuais, a seleção e melhoramento genético para hiperfagia (alto consumo) associadas a altas taxas de ganho de tecido dificilmente possibilitam a obtenção de respostas lineares para ganho, talvez até, devido à não correção nos níveis aminoacídicos das rações. O resultado normalmente seria uma resposta com ajuste não-linear (geralmente exponencial) para ganho (Figura 1), com maior sensibilidade para conversão alimentar e/ou eficiência alimentar (Bertechini, 2007; Guevara 2004; Dozier et al., 2008).

Figura 1. Simulação de desempenho em função do incremento nos padrões energéticos das rações.

Dessa forma, a avaliação da conversão alimentar passa a ser uma medida interessante para se avaliar a eficácia das enzimas, nestas situações. É importante ressaltar, que a conversão alimentar se trata da relação entre duas outras variáveis e nem sempre apresenta distribuição normal, fato este bastante questionado por estatísticos, mas ao mesmo tempo, retrata de forma técnica e econômica o resultado obtido e é tradicionalmente aceita nas publicações acadêmicas e referência na avicultura comercial. Após confirmação da importância dos controles (CP e CN) ao se avaliar enzimas em dietas com níveis nutricionais reduzidos (marginais), focamos para a importância do número de repetições a se utilizar. Convencionalmente as avaliações de desempenho utilizam no mínimo 4 repetições e dificilmente mais que 8 repetições por tratamento. O aumento no número de aves por repetição mostrase interessante para redução na variação do acaso, no entanto, pode começar a limitar quando este número afeta a condução operacional do experimento. Em frangos de corte, Potter (1972), relata que instalações com 50-60 aves por box (parcela) minimizaram as variações entre repetições, sendo que boxes maiores dificultam a condução da avaliação e a manutenção de condições uniformes no ambiente. Dessa forma, Euclydes & Rostagno (2002), concluem que o uso de 20-30 aves/box com número de repetições maiores que 8, seriam ideais para se conseguir minimizar o erro-padrão e por conseqüência evidenciar diferenças para características estatísticas de desempenho e carcaça sem prejuízos sob aspecto de condução operacional da avaliação. Para evidenciar a importância do número de repetições nas avaliações com enzimas, é apresentado na tabela 1, o número de repetições necessárias para se verificar diferenças entre dois tratamentos, em função do CV médio, partindo de um número convencional de repetições (6) e da diferença esperada entre as médias dos tratamentos.

Fica exposto a necessidade do aumento no número de repetições nas avaliações com enzimas, em relação às avaliações que visam medir diferenças maiores que 2% entre as médias. O aumento no número de repetições além de aumentar a possibilidade de detectar diferenças em um determinado cenário, é eficaz em reduzir o erro experimental e por conseqüência o CV, ou seja, em um determinado experimento com 6 repetições por tratamento obtém-se um CV específico, ao se extrapolar o número de repetições necessárias para estimar diferenças, consegue-se ao mesmo tempo, reduzir o CV. O uso de controle negativo é de suma importância tanto para evidenciar que o padrão utilizado (CP) é o ideal, quanto para demonstrar que os níveis praticados podem ser excessivos ou mesmo a matriz nutricional dos ingredientes está desajustada. Há que se ter cuidado, no entanto, pois a reduções nos níveis nutricionais, quando se pesquisa carboidrases e proteases, pro exemplo, as valorizações ou redução nos níveis nutricionais são da ordem de 1-2% no caso dos aminoácidos e de 2-3% (50-100 kcal) para energia metabolizável, em função disso o uso de um pequeno número de repetições poderá mascarar uma falsa hipótese de uso de níveis nutricionais excessivos em função da não diferenciação entre o controle positivo e o negativo. Os pesquisadores tem sido muito criativos ao avaliar diferentes CN’s e sua associação com as enzimas avaliadas e desta forma permitem interpretações e extrapolações gerar matrizes nutricionais com boa precisão, pois cercam as possibilidades de super e subestimar os efeitos das enzimas nas situações avaliadas, assim, com bom censo das empresas, produtos comerciais são designados com boas margens, pois as condições experimentais podem não expressar necessariamente como um todo, os desafios e formas de uso a campo. 2.3 Uso de enzimas em ensaios/estudos metabólicos Experimentos e ensaios metabólicos são extremamente importantes, para se entender de forma mais aprofundada e científica os efeitos das enzimas sob aspecto nutricional e fisiológico em aves.

Porém o grau de dificuldade e tempo em se conduzir estes estudos não podem ser comparados com estudos de desempenho, pois exigem, instalações adequadas e específicas para este fim, equipamentos e laboratórios e o mais importante equipe especializada para condução, desde o planejamento da avaliação, sua condução à campo, análises laboratoriais (etapa crítica), tabulação e análise estatística dos dados. Infelizmente, considera-se que mesmo algumas instituições de pesquisas e ensino não apresentam por completo estrutura necessária à condução destas avaliações. Um estudo mais aprofundado com avaliações de substratos (p.ex.: PNA’s, fitato, amido), nutrientes de interesse (aminoácidos) e a determinação da atividade enzimática nos produtos e/ou rações, no Brasil é praticamente impossível em uma única instituição em função da infra-estrutura física e recursos humanos. Este fato é sem dúvida uma preocupação, pois apesar de sermos grandes usuários das enzimas, às vezes, conhecemos de forma “abstrata” os seus efeitos fisiológicos, através da literatura internacional (teorias e hipóteses).

A compensação ocorre como relatado anteriormente, pesquisas (criativas) com foco no desempenho, muito bem estruturadas, com um bom número de animais e repetições e mensuração de características metabólicas relativamente fáceis de se avaliar, permitem aos pesquisadores e técnicos à campo posicionar a avicultura Brasileira em uma das mais modernas do mundo. Adaptações da técnica da substituição dos alimentos em uma ração referência permite estimar valores de aproveitamento energético e digestibilidade dos aminoácidos com o uso das enzimas e seus respectivos diferenciais para os alimentos ou matérias-primas de interesse. Entretanto o mesmo problema relatado referente ao grau do efeito das enzimas aqui, tem fator complicador extra que seria a maior variação ou erro experimental para variáveis metabólicas. As principais medidas em ensaios metabólicos no Brasil, que seriam a digestibilidade da meteria seca, da proteína bruta, energia digestível e metabolizável e retenção de fósforo (coleta ileal e total), apresentam CV variando em média de 5,5-10%. Ao se avaliar o diferencial nutricional de um complexo enzimático sobre um determinado alimento em condições de substituição na ração referência, ocasiona desbalanceamento nutricional, fato este que associado ao menor número de aves por unidade experimental, período curto de adaptação/avaliação e erro laboratorial na análise potencializa o erro experimental e dificulta a detecção de pequenas diferenças. A análise do milho por exemplo tende a ter uma determinada variação, ao passo que para o farelo de soja seria bem maior. Normalmente a avaliação da dieta ou ração referência com e sem enzimas gera a melhor resposta sob ponto de vista interpretativo. A determinação da digestibilidade dos aminoácidos (alvo direto e indireto das enzimas) além de ser um técnica difícil, ainda é onerosa para os padrões da pesquisa nacional, sendo que projetos de parcerias público-privada parecem ser principais fomentadores destas informações.

Por conseqüência da demanda comercial, maior parte das pesquisas com enzimas são conduzidas focando determinação de valorizações nutricionais específicas para determinado produto comercial (enzima ou complexo enzimático), na maioria dos casos conduz-se ensaios metabólicos que são posteriormente complementados com validações em experimentos de desempenho tanto em instituições de pesquisas, quanto em unidades experimentais de médias e grandes integrações. Por melhorarem o aproveitamento de nutrientes e da energia de uma ração o conceito tido como mais adequado com o uso de enzimas seria propor valorizações nutricionais para os ingredientes que apresentam o substrato específico de atuação da mesma, no entanto, em função de maior praticidade, o uso das chamadas “matrizes nutricionais” é bem aceito entre técnicos em nutrição na avicultura industrial. As variações nas inclusões dos diferentes ingredientes numa formulação em função da fase, gera cenários com diferentes padrões de substrato e portanto pode haver maior ou menor efetividade com o uso de matrizes nutricionais fixas que caracterizam a enzima ou complexo enzimático como um ingrediente na formulação (teoricamente).

A maioria das fitases de origem bacteriana apresentam hidrólise na posição do carbono 6 da molécula do fitato (hexafosfato de mio-inositol), daí, serem denominadas de 6-fitase, por outro lado algumas fitases fúngicas são denominadas 3-fitases pela especificidade em iniciar a hidrólise na posição 3. Não há estudos suficientes que permitam concluir uma maior ou menor eficácia em função no ponto de hidrólise no fitato, no entanto, é salutar afirmar que, a maioria das pesquisas apontam as fitases de origem bacterianas com maior estabilidade frente a enzimas endógenas e ampla faixa de atuação no trato digestório das aves e em alguns casos maior estabilidade à altas temperaturas relativas, quando comparadas à fitases fúngicas. Daí talvez, o apelo da denominação mercadológica de fitases geração mais recente. Entre os vários componentes que afetam a resposta com o uso de fitases, já é bem relatado em pesquisas nacionais e internacionais (Brito et al., 2008; Quian et al., 1997; Schoulten et al., 2003) uma maior eficácia na hidrólise de fitato pelas fitases, com o uso de níveis de cálcio moderados, ou seja, uma relação cálcio/fósforo total sempre menor que 1,35 para frangos de corte e uma redução exigência dietética na ordem de 5% aproximadamente, (0,2 pontos porcentuais) para poedeiras em produção. Há alguns motivos para este efeito, entre os quais pode-se destacar o poder do cálcio em aumentar o pH da digesta, principalmente o cálcio oriundo de fonte de alta solubilidade como o calcário (por exemplo), e pela formação de sais insolúveis com o fitato em regiões ainda passíveis de atuação das fitases no trato digestório. Sob ponto de vista pessimista (continuísmo), vale ressaltar a dosagem estática do uso das fitases, independente do produto comercial, da situação técnica e econômica a padronização de 300 unidades de fitase para poedeiras e 500 unidades de fitase para frangos foi estabelecida há muito tempo e parece ser um dogma da nutrição. Aos poucos, surgem pesquisas que visam maximizar a hidrólise do fitato com incremento na suplementação de fitase.

Estudos iniciais que estabeleceram a suplementação padrão de fitase para cada espécie (fase), pouco apresentavam níveis de fósforo aquém das deficiências marginais, fato este que possibilitaria maior eficácia na hidrólise. Como relatado anteriormente, não há, ou há pouquíssimos benefícios do uso de fitases “on-top”, assim, com pequenas diferenças entre deficiência marginal e nível mínimos não permite explorar adequadamente o efeito de maiores níveis ou suplementações. Considera-se o estudo conduzido por Shirley & Edwards (2003), como um divisor de águas com níveis de fitase, por demonstrar que há substrato disponível para hidrólise e a fitase maximiza seu efeito em dosagens mais altas para frangos de corte, sem prejuízos sobre o desempenho e qualidade óssea e incremento na utilização de aminoácidos e de energia das rações. Meneghetti et al. (2009), concluíram que a suplementação em até 4.500 FTU/kg é suficiente para um bom desempenho, qualidade óssea e otimiza o aproveitamento de nutrientes da dieta com redução nos níveis nutricionais de fósforo disponível (para 0,22% e 0,20 nas fases inicial e crescimento respectivamente), 4% nos níveis de proteína e aminoácidos de acordo com a fase e 85 e 60 kcal, nas fases inicial e crescimento, respectivamente. Seguindo a mesma ótica, Geraldo et al. (2009), verificaram que poedeiras comerciais suplementadas com 1.200 FTU/kg de ração (redução em 65 kcal, 3,5% PB e aminoácidos e fósforo disponível para 0,17%) apresentaram desempenho e qualidade de ovos semelhantes à poedeiras submetidas à uma dieta padrão (Atendimento das exigências da linhagem). Estes resultados e outros da literatura, acenam para um cenário interessante na produção avícola no que tange à fitase, ou seja, o planejamento do nível de suplementação pode ser reavaliado em função do substrato, do manejo técnico da granja além é claro do cenário econômico. Vale aqui ressaltar também, que a hidrólise linear do fitato com o uso de altos níveis de fitase possibilita redução na excreção de fósforo fítico e total para o ambiente, otimizando também um problema ambiental.

Pesquisas nacionais apontam a eficácia de produtos comerciais que apresentam diferenciadas margens de valorização na energia que por sua vez viabilizam a formulação das rações. Indiretamente enzimas com foco em PNA’s e amido podem influenciar a digestibilidade dos aminoácidos que passam a ser um benefício extra. Matrizes nutricionais e valorizações em ingredientes apontam valorizações dietéticas finais entre 40-120 kcal e 1-2% na digestibilidade dos aminoácidos. O uso associado entre fitases e carboidrase gerou um certo confundimento e indefinições sobre as valorizações mais adequadas, pois fitases são enzimas tidas como mais estabelecidas e apresentam efeito extra-fosfórico nas matrizes nutricionais, no entanto não são específicas para aumentar aproveitamento energético ou digestibilidade dos aminoácidos. Após condução de um grande número de avaliações, dificilmente teremos respostas baseadas em todos produtos presentes no mercado, porém por bom censo, muitos técnicos, consultores de mercado e pesquisadores apontam que em termos energético acima de 150 kcal seria um limiar perigoso trabalhar com valorização dietética com uso associado entre fitases e carboidrases.

Assim sendo, o uso de enzimas proteases com este objetivo ganhou espaço com a realização de pesquisas recentes. Com o uso de proteases, principalmente em demonstrou-se não somente melhor aproveitamento protéico e aminoacídico, mas também, da energia dos ingredientes básicos com compões uma dieta tipicamente brasileira (milho, farelo de soja e farinha de carne e ossos). A preocupação com estabilidade de outros tipos de enzimas exógenas a serem utilizadas simultaneamente, parece ter sido superada e hoje o uso de proteases é uma realidade, ampliando o leque de opções ao nutricionista e gestores avícolas.

Ainda permanecem desafios para a pesquisa, principalmente o estabelecimento de estratégias concretas com a utilização conjunta de várias espécies de enzimas, com conceitos teóricos embasados em resultados e explicações fisiológicas factíveis, visto que o melhoramento genético intenso aumenta ano após ano a capacidade e aproveitamento de nutrientes e por conseqüência a eficiência alimentar de aves e suínos, adequações regionais nos níveis nutricionais, visto que, margens de segurança e variabilidade nos ingredientes (composição e matrizes nutricionais) torna às vezes impraticável o uso do conceito de enzimas, possibilidade de recuperação/padronização da atividade (“potência”) de todas enzimas quando presentes nas rações (diluídas), possibilitando ajustes em dose-resposta e auxílio para formação de hipóteses. Durante anos de pesquisas, há que se ressaltar, a intensa evolução biotecnológica dos laboratórios que produzem/desenvolvem/especificam e melhoram (estabilidade) produtos (enzimas) comerciais.

Considera-se o uso de enzimas uma ferramenta extremamente importante nos dias atuais, pois os custos com alimentação são responsáveis em média com 70% dos custos de produção e sua otimização implicará necessariamente em redução nos custos por unidade de ganho. Atualmente a preocupação com resíduos excretados para o ambiente é uma realidade e em pouco tempo também irá compor o custo de produção e finalmente, as duas principais culturas agronômicas de interesse na cadeia aves e suínos estarão envolvidas direta ou indiretamente no cenário de produção de energia, ou seja, o custo energético (maior componente) em rações tende a sofrer mudanças e conseqüentemente a busca por alternativas já é e será ainda mais freqüente. O melhor aproveitamento de nutrientes e principalmente da energia dos ingredientes possibilitará a inclusão das enzimas nas matrizes de formulação com maior facilidade. O conhecimento de cada enzima associada ao seu substrato e relações, aliado a aspectos econômicos serão as formas mais coerentes de utilização deste aditivo em dietas avícolas.

AQUINO L.H. Técnica experimental com animais. 430p. UFLA- Lavras-MG. 1992. BERTECHINI, A.G; BRITO J.A.G Utilização correta de enzimas em rações de aves. 07p. 2007. In: Anais da AVEEXPO (Curitiba). BRITO J.A.G et al. In Anais do Prêmio José Maria Lamas da Silva, Conferência APINCO 2008, p.143 DOZIER W.A, CORZO. A. KIDD M.T Apparent metabolizable energy needs of broiler chick subjected to diverse ambient temperature regimens. Journal Applied Poultry Research, 17:134-140, 2008. EUCLYDES R.F; ROSTAGNO H.S. Conferência APINCO 2002 – FACTA,117-134p. 2002 Campinas. GUEVARA V.R., Use of nonlinear programming to optimize performance response to energy density in broiler feed formulation. Poutry Science, 83:147-151, 2004 MENEGHETTI C. et al. In Anais do Prêmio José Maria Lamas da Silva, Conferência APINCO 2009, NU113. MOHALLEN D.F. et al. In Anais do Prêmio José Maria Lamas da Silva, Conferência APINCO 2007, p.174 POTTER L.M. Desenhos experimentais em estudos nutricionais com frandos de corte. Zootecnia, 3:67–73, 1973. QUIAN, H., KORNEGAY, E.T., DENBOW, D.M., Utilization of phytate phosphorus and calcium as influenced by microbial phytase, cholecalciferol, and the calcium:total phosphorus ratio in broiler diets. Poultry Science, 76:37-46, 1997. SAKOMURA N.K.; ROSTAGNO H.S. Métodos de pesquisa em Nutrição de Monogástricos. FUNEP, 283p. 2007. SANTOS L.A et al., In Anais do Prêmio José Maria Lamas da Silva, Conferência APINCO 2009, NU032. SCHOULTEN, N. A. et al. Níveis de cálcio em rações de frangos de corte na fase inicial de criação suplementadas com fitase. Rev. Bras. Zootecnia, v. 32, p. 1191-1197 2003. SHIRLEY R.B; EDWARS H.M Jr. Graded levels of phytase past industry standards improves broiler performance Poultry Science, 82:671-680, 2003.