Desempenho produtivo e reprodutivo de matrizes de frangos de corte com dietas suplementadas com vitamina E, óleo de soja e óleo de peixe

No experimento, foram avaliados duas fontes de óleo (soja e peixe) e quatro níveis suplementares de vitamina E (0, 150, 250 e 350 mg/kg de ração) em dietas de matrizes de frangos de corte da linhagem Ross, entre a 42ª e a 56ª semana de idade. A adição de óleo de soja teve efeito no peso de ovos, quando não houve inclusão de vitamina E. A suplementação de 215,96 mg de vitamina E/kg de dieta em dietas com óleo de soja aumentou o percentual de postura. A adição de níveis crescentes de vitamina E acima das exigências, independentemente da fonte de óleo utilizada, melhorou a fertilidade. Não houve efeito para peso dos pintos, eclodibilidade, mortalidade e número de espermatozoides na membrana vitelínica ou em valores métricos de testículos.

Palavras-chave: eclodibilidade, fertilidade, matrizes de corte, vitamina E.
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Introdução

Em dietas à base de milho e farelo de soja, para matrizes pesadas, normalmente não é necessária a inclusão de óleos ou gorduras nas rações para atender às necessidades energéticas. Entretanto, seu uso poderia trazer outros benefícios, como aumentar o peso do ovo, melhorar a eclodibilidade, interferir no desempenho da progênie e na composição em ácidos graxos da gema, entre outros (Atteh e Lesson, 1984; Brake, 1990).

A utilização de óleo de peixe na dieta de matrizes de frangos de corte permite elevar a concentração de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) da série ômega 3, os quais estão envolvidos com a modulação de processos inflamatórios e imunológicos. O principal problema associado à inclusão de ácidos poli-insaturados n-3 é que estes são propensos à oxidação ou ao ataque de radicais livres e é necessária sua associação com antioxidantes. A vitamina E (vit E) e o selênio são antioxidantes naturais e componentes-chave para reduzir a peroxidação lipídica (Surai et al., 2000). A vit E evita a peroxidação dos PUFA que ocorrem nas membranas celulares e combate os radicais livres formados (Surai, 2002). Além desses fatores nutricionais, a suplementação de vit E melhora a fertilidade, a viabilidade embrionária e a produtividade em aves.

Os embriões de aves precisam de antioxidantes para protegê-los da lesão tecidual causada pelos radicais livres e pela peroxidação lipídica. Para esse fim, antioxidantes lipídicos são adicionados à gema do ovo durante a maturação do ovócito no ovário e esses antioxidantes são oriundos da dieta das matrizes (Surai et al., 1998a, b). O incremento nos níveis de vit E na ração pode levar ao incremento dos níveis de vit E nos ovos embrionados e nos tecidos do embrião, reduzindo a suscetibilidade à peroxidação lipídica (Surai et al., 1999), dessa forma reduzindo também o estresse bioquímico causado durante a incubação pela peroxidação.

Em matrizes Cobb com 46 semanas, foi observado que as aves reduzem a capacidade de incorporar carotenoides, importantes antioxidantes, na gema do ovo, levando a uma significante redução na coloração da gema (Cherian et al., 2007). Os carotenoides são antioxidantes naturais, como a vit E, e sua diminuição nos ovos deixaria os embriões susceptíveis ao estresse oxidativo, típico da incubação. Sendo assim, a adição de antioxidantes em matrizes velhas deve melhorar essa condição.

A nutrição da matriz afeta também o desempenho dos pintos. Muitos desafios de agentes patogênicos evacinais acontecem nos primeiros dias de vida, portanto a exigência da matriz em nutrientes específicos com função imunomoduladora assume um importante papel na transferência de imunidade materna e na resposta imune dos pintos. A suplementação na ração dos pintos com vit E também interfere na resposta imunitária das aves (Erf et al., 1998; Leshchinsky e Klasing, 2001).

Os antioxidantes naturais, incluindo a vitamina E, o selênio e os carotenoides, possuem também um importante papel na reprodução aviária (Freisleben e Packer, 1993). A vitamina E (vit E) melhora a qualidade do sêmen e a habilidade de fertilização em machos, o que previne a peroxidação lipídica das membranas dos espermatozoides (Biswas et al., 2009) e, consequentemente, leva a um aumento na concentração espermática, melhora a motilidade, bem como o status antioxidante do sêmen, e reduz anormalidades (Eid et al., 2006). Naturalmente encontrada no esperma de galos e perus, a vit E está envolvida na manutenção da integridade e da motilidade espermáticas (Donoghue e Donoghue, 1997), e sua suplementação na dieta de matrizes permite o aumento na performance reprodutiva destas.

Neste trabalho, foi testada a hipótese de que a oxidação de diferentes fontes de óleo em dietas de matrizes poderia ser compensada pela ação antioxidante da vitamina E adicionada à ração. Sendo assim, óleos de soja e de peixe foram associados a diferentes níveis de vitamina E, na ração de matrizes, com o objetivo de se analisar a influência dessas variáveis sobre parâmetros produtivos e reprodutivos.

O experimento foi conduzido no aviário experimental da Universidade Federal do Paraná - Campus Palotina, constituído de 32 boxes com dimensões de 2,5 x 1,5 m, cobertos com maravalha (±10 cm) sobre o piso. Foram utilizados boxes telados e providos de um bebedouro pendular e de dois comedouros, um para os machos e outro para as fêmeas. Em cada boxe experimental, foram utilizados ninhos convencionais de um andar, com quatro bocas, de madeira, com dimensões de 1,20 m x 0,30 m x 0,30 m a 0,35 cm acima do nível do piso.

Foram utilizados 416 reprodutores de frangos de corte (384 fêmeas e 32 machos) da linhagem Ross. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso, em esquema fatorial 2 x 4, com duas fontes de óleo (soja e peixe) e quatro níveis suplementares de vit E (0, 150, 250 e 350 mg/kg de ração), totalizando oito tratamentos e quatro repetições. O período experimental teve início na 42ª semana e foi finalizado na 56ª semana de idade das aves.

O programa de iluminação foi mantido constante com 17 horas de luz diárias. O fornecimento de ração foi limitado e controlado diariamente, de acordo com as recomendações do manual da linhagem, enquanto o de água foi ad libitum. As exigências nutricionais utilizadas para a formulação das dietas das fêmeas e dos machos foram baseadas nas recomendações contidas no manual da linhagem. Foram formuladas duas dietas basais, de acordo com a fonte de óleo e os diferentes níveis de vitamina E em substituição ao inerte. O óleo, independentemente da fonte utilizada, foi adicionado em todas as rações experimentais, na quantidade de 1,5% (Tab. 1). Os machos de cada unidade experimental receberam a ração correspondente ao tratamento recebido pelas matrizes.

Foi determinada a produção de ovos diariamente, e na 52ª semana de idade das matrizes, todos os ovos íntegros produzidos em cada repetição foram pesados para avaliação do peso médio do ovo.

Na 51ª semana, foram realizadas duas coletas de ovos de todas as repetições experimentais. Os ovos foram pesados e distribuídos em quatro incubadoras, com capacidade para 120 ovos cada. As incubadoras foram reguladas e monitoradas diariamente, para se manter a temperatura e a umidade relativa em 37,5°C e 55%, respectivamente, até o final da incubação.

Após a eclosão, os ovos não eclodidos foram abertos para se determinar a fertilidade e a mortalidade embrionária e a eclodibilidade, e os pintos nascidos foram pesados e comparados com o peso dos ovos.

Para se identificar o número de espermatozoides na membrana vitelínica, na 50ª semana de idade, foram coletados todos os ovos produzidos em um dia. Os ovos foram identificados e armazenados a 4°C. Os ovos foram quebrados e classificados como férteis ou inférteis, em função da morfologia do disco germinativo (Kosin, 1945; Fig. 1A-B). Dos ovos férteis foram obtidos fragmentos de 1 x 1 cm da membrana vitelínica sobre o disco germinativo (área 1) e no polo oposto a este (área 2). Os fragmentos foram lavados em NaCl 1%, dispostos sobre lâminas de vidro e foram tratados com DAPI (diamidinofenilindole) (1μg mL-1 em PBS), recobertos com lamínula e vedados com esmalte de unha (Donoghue e Donoghue, 1997). As lâminas foram analisadas em até 48 horas, em microscópio de fluorescência para luz ultravioleta, em objetiva de 40X (Fig. 1C). Foram analisados cinco campos de microscópio (área total 0,72 mm2) de cada região (disco germinativo e polo oposto) e contados os espermatozoides (sptz), representados em sptz/mm2.

Às 52 semanas de idade, os machos foram abatidos, os testículos coletados, pesados, medidos, e os fragmentos colhidos para análise histológica. Os fragmentos (0,5 cm) foram fixados em Bouin, emblocados em parafina e processados para rotina histológica. Cortes de 5 μm foram analisados em microscópio de luz, corados em hematoxilina e eosina, e foram determinados a altura do epitélio seminífero e o diâmetro dos túbulos seminíferos. As mensurações foram realizadas com o software Motic Image Plus 2.0. Em cada galo, foram obtidas 50 medidas de forma aleatória, em diferentes campos e cortes, para cada variável. Apenas túbulos seccionados transversalmente foram considerados.

Os dados obtidos foram verificados quanto à igualdade de variâncias antes do prosseguimento das demais análises. Uma vez comprovada a normalidade das variáveis, estas foram analisadas pelo procedimento GLM do pacote estatístico SAS, 2000, ao nível de 5% de probabilidade. Aquelas variáveis que não atenderam a normalidade foram submetidas ao método de transformação pelo procedimento RANK do pacote estatístico SAS (2000), sendo posteriormente analisadas pela ANOVA no modo GLM.

No presente trabalho, foram avaliados os efeitos da suplementação da vitamina E e de diferentes fontes de óleo (soja e peixe) na dieta de matrizes da linhagem Ross sobre as características produtivas e reprodutivas. Os resultados estão apresentados nas Tab. 2 a 4.

Na Tab. 2, estão apresentados os valores médios de produção de ovos e de incubação de matrizes de corte. De acordo com os resultados, houve interação significativa (P < 0,05) entre as fontes de óleo e a suplementação de vitamina E para peso dos ovos. Desdobrando a interação, observou-se que apenas a suplementação de vitamina E em dietas com óleo de peixe afetou o peso dos ovos das matrizes de forma linear crescente (Y = 64,048 + 0,00591x, R2 = 0,73; Fig. 2). Por outro lado, comparando-se as fontes de óleo dentro de cada nível de vitamina E, houve um aumento no peso dos ovos cujas matrizes receberam óleo de soja na dieta em comparação com óleo de peixe apenas quando não houve suplementação de vitamina E. A adição de níveis de vitamina E além daquele utilizado em dietas convencionais não trouxe benefício ao peso do ovo, independentemente da fonte de óleo utilizada. A adição de óleo de peixe em dietas de matrizes aumenta o peso do ovo se as dietas forem suplementadas por níveis de vitamina E acima daqueles utilizados em dietas convencionais.

Conforme a idade avança nas matrizes, o peso do ovo e o da gema aumentam significativamente (O’Sullivan et al., 1991), no entanto a quantidade de lipídeos não, uma vez que, com a idade, as aves reduzem a capacidade de agregar lipídeos à gema e aumentam os níveis sanguíneos de LDL, HDL e colesterol (Latour et al., 1996). Desta forma, um ovo maior com gema maior não significa um embrião que terá maiores fontes nutricionais durante seu desenvolvimento.

Os embriões de aves caracteristicamente acumulam grandes quantidades de lipídeos poli-insaturados nos seus tecidos, levando a uma predisposição ao estresse oxidativo nos últimos dias da incubação e nas primeiras horas de vida (Noble e Speake, 1997). Para se prevenir o estresse oxidativo e proteger os tecidos, os embriões também acumulam antioxidantes nos seus tecidos, como é o caso da vit E (Surai et al., 1999).

A suplementação de vit E na ração aumenta os níveis de vit E na gema (Kirunda et al., 2001), fornecendo ao embrião uma proteção maior ao estresse oxidativo que ocorre durante a incubação. Cherian et al. (2007) descreveram que modificações na dieta alteraram o perfil lipídico de ovos de galinhas poedeiras que receberam dietas com ácido linoleico ou com óleo de peixe, havendo transferência de ácido graxos para o ovo.

Para a porcentagem de postura, houve interação significativa (P < 0,05) entre a fonte de óleo e os níveis de vitamina E. A utilização de níveis crescentes de vitamina E em dietas com óleo de soja alterou de forma quadrática (Y = 49,858 + 0,1641x – 0,00038x2, R2 = 0,92) a postura de ovos. O maior percentual de postura foi estimado com suplementação de 215,92 mg/kg de vit E acima do nível utilizado no premix que compõe a ração das matrizes (Fig. 2).

O peso dos pintos não teve influência da fonte de óleo ou da suplementação de vit E neste experimento. Já o peso do pinto em relação ao peso do ovo foi maior (P < 0,05) em pintos cujas matrizes receberam óleo de peixe.

A eclodibilidade não teve influência das fontes de óleo ou da suplementação de vit E, assim como a mortalidade durante a incubação. O processo de eclosão é considerado um período de alto estresse oxidativo (Surai, 2002) e, segundo esse princípio, aumentar os níveis de antioxidantes nos tecidos do embrião, via ovo, poderia ter efeito sobre a eclodibilidade. Já foi demonstrado que, além da vit E, ocorre transferência para a gema do ovo de outros antioxidantes como o Se e os carotenoides (Surai et al., 1998b). O efeito sobre a eclodibilidade é mais nítido em aves que sofreram condições estressantes, como, por exemplo, ao consumirem toxinas T-2 (Tobias et al., 1992). No presente trabalho, essa possível característica não teve efeito significativo na eclodibilidade.

Com relação aos parâmetros reprodutivos, a fertilidade foi influenciada de forma linear (Y= 75,461 + 0,0418x; R2 = 0,61) pelos níveis de vit E, independentemente da fonte de óleo (Tab. 2; Fig. 2). A idade é um fator adverso no sucesso reprodutivo das aves, e em galinhas a relação com o decréscimo na reprodução tem sido muito bem descrita (Robinson et al., 1990). Os principais fatores citados são a redução na produção de ovos associada à provável redução da habilidade de reter espermatozoides nas glândulas da junção uterovagina, local de estocagem dos espermatozoides (Fasenko et al., 1992); o declínio na habilidade de transportar esses espermatozoides para o local de fertilização; e a possível redução no número de receptores para espermatozoides na superfície do oócito (Bramwell et al., 1996).

Essa diminuição na fertilidade em galinhas velhas pode ser contornada, até certo ponto, pelo aumento no número de espermatozoides em inseminações artificiais, por exemplo, ou pelo aumento do número de inseminações por intervalo de tempo (Bramwell e McDaniel, 1986; Brillard, 1993). Já nos galos a redução na fertilidade está associada à redução no número de espermatozoides no ejaculado de volume de sêmen produzido e à redução da habilidade de monta deles (Lake, 1989). Matrizes Cobb que receberam adição de 1,75% de óleo de peixe +1,75% de óleo de fritura apresentaram, nas 46 semanas de vida, eclosão de 98,6% e fertilidade de 80% (Cherian et al., 2008).

Um método para estudar e quantificar a eficiência reprodutiva em aves é estimar o número de espermatozoides que interagem com o oócito, no infundíbulo, como, por exemplo, o número de espermatozoides na membrana vitelínica externa, ou o número de buracos produzidos pelos espematozoides na membrana vitelínica interna (Wishart, 1987; Hazary et al., 2000).

Analisar a interação do espermatozoide com o ovo e, assim, determinar o número de espermatozoides ou de buracos causados por estes na membrana vitelínica representa uma possibilidade não invasiva de inferir quantos espermatozoides atingiram o local de fertilização no trato reprodutivo da fêmea durante a fecundação, estabelecendo, de forma indireta, a sua capacidade reprodutiva (Wishart e Staines, 1999).

A contagem de espermatozoides na membrana vitelínica de ovos férteis sobre o disco germinativo (área 1) não foi influenciada pelos tratamentos experimentais, já na área oposta houve efeito da fonte de óleo, sendo observados mais espermatozoides nos ovos obtidos dos tratamentos que receberam óleo de peixe (Tab. 3; Fig. 3). A dispersão dos dados em relação às duas regiões vitelínicas observadas demonstrou que os machos que receberam óleo de peixe produziram mais espermatozoides, uma vez que maior quantidade de ovos com mais de 100 sptz/mm2 foi observada nas membranas vitelínicas dos ovos obtidos de matrizes que receberam dietas formuladas com óleo de peixe (Fig. 3). Esse parâmetro apresenta altíssima fonte de variação, pois os ovos férteis apresentaram, em geral, número mínimo e máximo de sptz/mm2 para área sobre o disco germinativo de 11 a 152 e de 6 a 497, em ovos de matrizes que receberam ração com óleo de soja e óleo de peixe, respectivamente.

Ovos de galinha podem conter mais de 250.000 espermatozoides na membrana vitelínica, e, em galinhas, o número de espermatozoides presos nessa membrana é cerca de 10x mais que o número de buracos causados pelos espermatozoides (Wishart, 1997). Ovos de peruas e galinhas possuem 50% de chance de serem férteis quando em torno de três espermatozoides penetram na camada perivitelínica interna sobre o disco germinativo e máxima fertilidade quando pelo menos seis espermatozoides penetram nessa região, sendo a fertilidade em galinhas e peruas uma função dos espermatozoides estocados e transportados no oviduto das fêmeas (Wishart, 1997).

O maior número de ovos com maior número de espermatozoides observados nas matrizes alimentadas com óleo de peixe é, provavelmente, resultado do efeito que o óleo de peixe tem sobre a composição da membrana celular. Os espermatozoides de aves são únicos, com uma composição lipídica rica em ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (PUFAs) na fração fosfolipídica da membrana celular (46 a 54,4%). Tais células são altamente suscetíveis à peroxidação. Essa é a razão de nas aves haver a necessidade de agentes antioxidantes para preservação e manutenção da qualidade do sêmen, por exemplo, principalmente quando este é manipulado, como ocorre nas inseminações artificiais (Cerolini et al., 2005). A suplementação na dieta de galos leva ao aumento nas concentrações de vit E no sêmen, no testículo e no fígado (Surai et al., 1997). Apesar das comprovadas ações da vit E nos espermatozoides, no presente trabalho o número de espermatozoides recuperados na membrana vitelínica do ovo não teve influência da suplementação de vit E na ração das matrizes.

A manipulação da dieta causa alterações na composição de PUFAS na membrana dos espermatozoides (Blesbois et al., 1997; Kelso et al., 1997), com efeito direto sobre as variáveis seminais (Cerolini et al., 2005). Embora neste trabalho não tenham sido realizadas análises do sêmen, os resultados de fertilidade demonstram que os machos que receberam incremento nos níveis de vit E na ração apresentaram potencial maior de fertilizar os ovos de suas fêmeas. Esse efeito foi devido à provável ação antioxidante que a vit E teve sobre os PUFAS na membrana celular dos espermatozoides, permitindo que um maior número destes chegasse ao oviduto e fertilizasse o óvulo, bem como um maior número de ovos com grande número de espermatozoides fossem encontrados nos tratamentos com óleo de peixe.

A adição de níveis moderados (150 UI) de vit E na ração melhorou a fertilidade e reduziu as anormalidades dos espermatozoides em codornas (Biswas et al., 2007) e em machos caipiras indianos da raça Kadaknath (Biswas et al., 2009).

Na Tab. 4, estão demonstrados os valores da biometria macro e microscópica dos testículos dos reprodutores alimentados com dietas suplementadas com óleo de soja ou de peixe e vit E. Não houve efeito dos tratamentos para essas características. As médias gerais obtidas foram de 14,44 g de peso e 4,48 cm de comprimento por 2,45 cm de largura, com 14,14 mL3 de volume. Histologicamente, as médias gerais foram de 43,17 μm de altura do epitélio germinativo e 200,57 μm de diâmetro para os túbulos seminíferos.

O peso e o tamanho dos testículos em aves estão diretamente relacionados com a produção de espermatozoides, e quanto maior o órgão maior a produção e a concentração por ejaculado de espermatozoides (Moller e Erritzoe, 1988; Briskie e Montgomerie, 2007). Em geral, há uma relação positiva entre o peso corporal e o peso testicular dos machos de aves, e os testículos podem representar até 1% do peso corporal (Lake, 1981). Os dados apresentados sugerem que as dietas propostas não tiveram interferência sobre essas variáveis, uma vez que não foram observadas diferenças significativas.

Durante o desenvolvimento do experimento, notou-se que, em duas unidades experimentais, os ovos estavam com altíssima infertilidade, coincidentemente nos tratamentos-controle, os quais não receberam suplementação de vitamina E. No final do experimento, durante o abate dos machos, estes apresentaram peso testicular reduzido, com 2,06 e 3,92 g, em média, entre os testículos direito e esquerdo, com evidente degeneração testicular quando comparado à média geral de 13,27 g encontrada nos demais machos. Na análise histológica, a regressão testicular foi nítida, com testículos apresentando epitélio seminífero baixo, com 15,7 μm e 28,5 μm de altura, e túbulos seminíferos com diâmetro reduzido de 115,4 μm e 105,6 μm, respectivamente. Pela evidente redução na atividade testicular nesses machos, os dados de produção dessas unidades experimentais foram desconsiderados no experimento.

A adição de óleo de soja aumentou o peso dos ovos de matrizes de frangos de corte pós-pico, em comparação ao óleo de peixe, apenas quando não houve suplementação acima das exigências de vitamina E. A adição de óleo de peixe aumentou o peso dos ovos quando as dietas foram suplementadas por níveis de vitamina E acima daqueles utilizados em dietas convencionais. A suplementação de 215,96 mg de vitamina E/kg de dieta acima das exigências em dietas formuladas com óleo de soja aumentou o percentual de postura. A adição de níveis crescentes de vitamina E (0 a 350 mg/kg) acima das exigências, independentemente da fonte de óleo utilizada, melhora a fertilidade. A fonte de óleo e os níveis de vit E não tiveram efeito no peso dos pintos, na eclodibilidade, na mortalidade e no número de espermatozoides que chegaram ao oócito no momento da fertilização ou em valores métricos de testículos em matrizes de corte com até 56 semanas de idade.

Os autores agradecem o suporte financeiro do CNPq para o desenvolvimento do projeto.

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