Coccidiose enzimas saúde intestinal

O termo "problemas de saúde intestinal em frango de corte" se utiliza de maneira generalizada com relação a coisas que têm diferentes significado para cada um (Truscott e Al-Sheikhly, 1977; Tierlynck et al., 2009). A notoriedade dos problemas associados a mudanças na microflora intestinal (disbacteriose) aumentou até transformar-se num aspecto que afeta fortemente a produção, desde a proibição do uso de antibióticos promotores do crescimento na União Europeia (Hoerr, 1998; Lee, 2002). Não obstante, continua sendo um desafio comum, em qualquer ambiente de produção de frangos sobre material de cama. Os sintomas externos mais comuns desta patologia são diarreia, fezes aquosas e mal formadas que, sob circunstâncias mais severas, podem ter cor amarela e aspecto espumoso (Wilson, 2005). Quando este sinal se combina com partículas de ração sem digerir, alguns autores o descrevem como "trânsito rápido" (em inglês "feed passage" ou "flushing") (Collier et al., 2003; Dibner et al., 2009). Em geral, todas estas manifestações produzem cama úmida e aumentam a mortalidade, além de apresentar toda uma ampla gama de problemas secundários, incluindo enterite necrótica (EN) e dermatite gangrenosa, além de pododermatite e sinovite, redução na uniformidade das carcaças e níveis elevados de mortalidade, tanto no campo como no matadouro (Prescott et al., 1978).

O estudo sintomático dos problemas de saúde associados à disbacteriose se complica pelo fato de que existe uma grande variedade de fatores que interagem com a etiologia. Em muitos casos, os fatores iniciais podem ser uma infecção parasitária leve, patogênicos exógenos ou toxinas. A resposta do animal a estas agressões contribui significativamente para o desenrolar do problema e com seu impacto final sobre o rendimento do lote; no entanto, raras vezes aparecem manifestações clínicas claras, por isso o termo que tem sido utilizado para descrever este problema de saúde intestinal é enterite subclínica (Hoerr, 1998; McQuard, 1998). O propósito deste relatório é descrever um modelo que possa ser reproduzido e que proporcione uma maneira de criar enterite subclínica para poder possibilitar o estudo sistemático dos fatores que interagem para agravar ou mitigar esta síndrome.

Realizou-se uma série de experimentos para validar este modelo, como uma maneira de estudar os fatores que contribuem para mitigar os efeitos da enterite subclínica. Como primeira prova do princípio se realizou um experimento com frangos de corte de 28 dias, que receberam uma dieta com 22% de proteína bruta (PB), 1.21%/1.07% de lisina digerível total, que se administrou em forma de farelo e que continha 33% de centeio,  25% de trigo e 31% de pasta ou farelo de soja. O desenho de um arreglo fatorial 2 X 3 (dois fatores) de Eimeria com ciclagem na forma de uma sobredose tripla (3X) de uma vacina que contém oocistos vivos de 3 espécies do protozoário (ADVENT^® para controle de coccidiose) ou então nada, e 3 fatores de aditivos alimentares: um testemunha negativo, um antibiótico (disalicilato metileno de bacitracina, 60 ppm: BMD) ou uma mescla de enzimas para polissacarídios não amiláceos (NSP) que continha xilanase, glucanase e glucosidase (CIBENZATM CSM).

A superdose da vacina coccidial nesta dieta de alta viscosidade causou uma redução da ordem 4% a 5% (P<0.01) na eficiência de ganho de peso, mas não houve interações com os efeitos de nenhum dos aditivos alimentares. Por isso, os resultados são apresentados como efeitos principais mediados entre o desafio com coccidiose. O fato de acrescentar os aditivos alimentares melhorou o Índice de Rendimento a 28 dias ((ganho no período*viabilidade no período)/eficiência alimentar no período), IP de 145 para o testemunha a 188 e 284 para o antibiótico e as enzimas NSP, respectivamente (P<0.01).  O melhoramento no IP foi mais constante com as enzimas NSP que com o antibiótico, e se associou também a uma redução significativa na viscosidade do bolo alimentar (P<0.01) em toda a extensão da prova. As enzimas NSP também se associaram a uma redução de 1.5 a 2.5 log no cultivo de Cp do intestino grosso e da porção posterior do íleo (P<0.01), o que coincide com um relatório prévio (Choct et al., 2006). No entanto, o antibiótico não teve efeito significativo sobre o número de Cp. A viabilidade geral na prova foi superior a 95% e não houve diferenças relacionadas com os tratamentos, nem mortes relacionadas com o Clostridium.

A morfometria intestinal nos dias 15 e 22 do estudo foi utilizada para avaliar a saúde deste órgão com relação aos diversos tratamentos utilizados na prova. A superdose de vacina coccidial afetou negativamente a morfometria intestinal, com uma redução significativa no desenvolvimento da mucosa, na altura das pelosidades e uma proporção elevada (nociva) entre criptas e pelosidades no duodeno e na porção intermediária do intestino delgado, tanto a 15 como a 22 dias, em comparação com os testemunhas não desafiados. Estes efeitos negativos, que são congruentes com as respostas inflamatórias locais, foram mais evidentes na porção média do intestino delgado das aves desafiadas, que não receberam as enzimas NSP, no dia 15, mas a morfometria ileal não foi afetada significativamente a 15 nem a 22 dias por nenhum dos aditivos, nem pelo desafio coccidial. A adição das enzimas NSP melhorou a morfometria intestinal (duodeno e porção média do intestino delgado), julgando pela redução na proporção entre criptas e pelosidades, o que indica que pelo menos uma parte do melhor rendimento foi causado por uma melhor saúde intestinal e a uma redução nas demandas para a proliferação do talo celular das criptas.  

Estes resultados indicam que é um desafio para as aves serem submetidas a ingredientes que contêm polissacarídeos não amiláceos, pois produziu inflamação intestinal e estimulou o crescimento de C. perfringens na porção posterior do trato gastrointestinal. Além disso, a adição de enzimas que digerem os NSP e, em menor grau, o antibiótico, promoveram o rendimento, enquanto que as citadas enzimas diminuíram a inflamação intestinal e reduziram o crescimento exagerado da citada bactéria.

Na segunda prova, a dieta foi modificada para avaliar o impacto de uma fonte de proteína de origem animal com menor capacidade de ser digerida do que o farelo ou pasta de soja, quando administrados  a frangos de 1 a 21 dias de idade. Em estudos prévios, foi detectado que o nível de farinha de peixe, ao contrário do que aconteceu com o concentrado de proteína de soja, incrementou significativamente o crescimento do C. perfringens no íleo e no ceco dos frangos (Drew et al., 2004). Em nosso experimento, agregamos 7% de farinha de penas a uma dieta completa, formulada com 23.5% de PB e 1.38%/1.21% de lisina total/digerível. Desafiamos todas as aves com o triplo (3X) da dose da mesma vacina elaborada com oocistos vivos de coccídia, no primeiro dia de idade, e os tratamentos com aditivos alimentares foram utilizados segundo um desenho com arranjo fatorial 2 X 2 X 2, com e sem betaína, enzimas para NSP (Cibenza CSM), uma protease (Cibenza DP100) e uma combinação dos dois tipos de enzimas. Foi divulgado que a betaína melhora o equilíbrio osmótico e o rendimento em presença de desafio coccidial (Allen e Fetterer, 2002) e melhora a eficiência da resposta imune inata (Klasing et al., 2002).   

O índice de rendimento melhorou com a adição de enzimas NSP (P<0.01), o que foi moderadamente mais efetivo em presença do osmólito de betaína (Bet X CSM = 0.037). Houve somente uma modesta melhora em IP, com a adição da protease sozinha, o que não se observou em presença da betaína (Bet X DP100 = 0.049), devido principalmente a um melhoramento no IP do testemunha negativo em presença de betaína. A adição de protease às enzimas NSP não melhorou mais o IP. 

A maior redução da viscosidade digestiva foi alcançada com as enzimas NSP (P<0.01), no entanto, a protease reduziu a viscosidade em presença de betaína (Bet X DP100 <0.05). Uma vez mais, a adição das enzimas NSP reduziu a presença de C. perfringens, com relação aos outros tratamentos, em 1.5 a 2 logs (P<0.01) a partir de amostras obtidas somente da porção posterior do íleo. Foi medida no soro a proteína de fase aguda AGP da função da barreira intestinal. Esta proteína é indicadora de uma resposta imune sistêmica e, consequentemente, uma elevação em AGP sugeriria uma certa falha na função de barreira. Os resultados indicaram que tanto a protease como as enzimas NSP reduziram os níveis de AGP de maneira semelhante, em presença da betaína, e que a combinação dos dois tipos de enzimas teve um efeito aditivo (P<0.05). Este sugere que, na presença de um osmólito, os dois tipos de enzimas têm certo efeito positivo sobre a função de barreira intestinal neste modelo de enterite subclínica. Contudo, enquanto que a adição de enzimas NSP a esta dieta reduziu as concentrações de C. perfringens no íleo, não houve evidência de que a adição da protease nesta dieta alta em farinha de penas tivesse algum impacto inibidor semelhante sobre o crescimento de C. perfringens. É possível que a alta viscosidade associada à dieta rica em polissacarídeos não amiláceos tenha impedido a interação apropriada da protease com seu substrato.

Como o objetivo de examinar o impacto da proteína da ração sobre a concentração de C. perfringens no íleo e sobre a função de barreira intestinal, utilizamos duas dietas, uma sem proteína animal e formulada a 22% PB e 1.38%/1.21% de lisina total/digerível, a segunda dieta foi quase idêntica à primeira com a exceção de que continha 14% de farelo de frangos (HP) e se formulou para proporcionar um excesso de PB (30%) e lisina total e digerível (1.65%/1.38%). Preocupa-nos que o alto nível de centeio (38%) na prova 2 pudesse ter derrotado qualquer possível efeito da protease como resultado da muito alta viscosidade da dieta. Portanto, na prova 3, o nível de centeio da ração se reduziu de 38% a 20%, agregando milho para compensar a diferença de energia. Novamente, todas as aves foram submetidas a uma superdose da mesma vacina elaborada com oocistos coccidiais vivos, com a exceção de que, neste caso, foi aplicada a 7 dias do estudo em vez de fazê-lo no primeiro dia.  

Os resultados a 28 dias indicaram uma redução em IP com a dieta que continha 30% proteína de farelo de frango, que se incrementou ao das dietas normais em proteína, com a adição da protease. Mesmo quando estes resultados não são significativos, indicam no mesmo sentido a possibilidade de que um excesso de proteína no intestino grosso pudesse exercer uma influência que promovesse o crescimento bacteriano exagerado e, consequentemente, uma influência negativa sobre o rendimento. As concentrações de C. perfringens no íleo foram significativamente mais baixas que continha o nível normal de proteína do que se observou na prova 2 (~2.4 log vs. ~5.0 log) o que provavelmente seja devido à redução no conteúdo de centeio da dieta nesta prova. Os níveis ileais de C. perfringens, na dieta com 30% de PB com farelo de frango, se incrementaram aproximadamente 2 unidades log em comparação com a dieta que continha o nível normal de proteína (P<0.01). A adição da protease à dieta com o nível normal de proteína não teve impacto sobre os níveis ileais de C. perfringens, mas a adição da protease à dieta alta em proteína causou uma redução de 2 log em C. perfringens a níveis semelhantes aos observados com a dieta com proteína normal. Semelhante aos resultados observados na prova 2, a adição da protease nesta prova gerou reduções nos níveis séricos de AGP  (P<0.10) independentemente do nível de proteína na ração. Estes resultados indicam que a redução ao mínimo do fluxo de proteína animal digerível para o intestino grosso, em presença de enterite subclínica reduz os níveis de C. perfringens, seja que isto se deva a um menor nível de proteína na ração ou à adição de protease para aumentar sua digestibilidade  na porção anterior do trato gastrointestinal, minimizando assim o fluxo de proteína para o intestino grosso. Além disso, a adição da protease neste modelo de desafio da saúde intestinal melhorou a função de barreira intestinal, segundo se determinou medindo a resposta em proteína de fase aguda, independentemente do nível proteico da ração.

O propósito destas três provas foi avaliar a validez de um modelo de desafio da saúde intestinal, desenhado para produzir enterite subclínica em frangos de corte jovens. Tendo bom resultado, ele poderia proporcionar um sistema que facilitaria o estudo dos muitos fatores que interagem para contribuir com este problema tão disseminado e, muitas vezes, imprevisível. O marco teórico de trabalho para este modelo se prediz sob o conceito de que: 1) a inflamação intestinal e o estresse oxidativo, 2) a falha digestiva com, 3) o aumento no fluxo de nutrimentos ao intestino grosso e 4) a falha na barreira intestinal são, todos eles, fatores que participam, em diferentes graus, do desafio da saúde intestinal. Os resultados mostraram que cada um destes 4 fatores está influenciado por este modelo e a falta de mortalidade significativa é consistente com o modelo de desafio subclínico intestinal  que tentamos criar.   

Estes estudos observaram, principalmente, a influência de um maior fluxo de nutrimentos para o intestino grosso, que estimula o crescimento de C. perfringens, e demonstrou o papel que as enzimas digestivas específicas do substrato desempenham para minimizar o crescimento de C. perfringens e respaldar a manutenção da saúde intestinal. Também observamos que, mesmo quando C. perfringens é um marcador reproduzível do crescimento exagerado de um patogênico potencial no intestino, não existe a necessidade de desafiar as aves com um C. perfringens exógeno para produzir estes efeitos. De fato, é possível que esta abordagem seja mais semelhante ao que acontece no campo. O sistema do presente modelo será utilizado no futuro para avaliar fatores adicionais que possam apoiar a manutenção da função da barreira intestinal, modular a resposta inflamatória no intestino e o estresse oxidativo resultante, e promover a manutenção de uma microbiota apropriada no intestino grosso do frango.

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