Técnicas moleculares diagnóstico

As técnicas moleculares de diagnóstico se baseiam na detecção e na análise de sequências de genomas e os produtos da expressão de genes, permitindo uma detalhada e precisa caracterização e diferenciação de microrganismos nem sempre possível com técnicas de diagnóstico as sorológicas ou de isolamento do agente infeccioso. Os métodos moleculares trouxeram grandes avanços no diagnóstico de novas variantes de agentes infecciosos, na identificação de determinantes de para a diferenciação entre agentes não patogênicos e patogênicos, análises da evolução e distribuição geográfica e temporal de patógenos causadores de importantes doenças.

As técnicas de PCR (reação de polimerase em cadeia) e PCR em tempo real, o PCR em tempo real quantitativo para análises da expressão gênica, ensaios de hibridização de DNA ou RNA, tecnologia de microarranjos para diagnóstico ou análises de expressão gênica, sequenciamento de DNA por eletroforese capilar e as técnicas de seqüenciamento de nova geração para sequeciamantos em larga escala de genomas completos, são exemplos das ferramentas básicas da biologia molecular mais usualmente aplicadas na pesquisa e que já estão ou em breve virão a ser incorporadas em rotinas de diagnóstico de doenças infecciosas das aves.

Técnicas de DNA recombinante são também aplicáveis no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e envolvem primeiramente a clonagem de genes, ou seja, a sua inserção em vetores procarióticos ou eucarióticos, geneticamente modificados para seu uso diferentes organismos.  Estes vetores são utilizados para a síntese in vitro de proteínas codificadas pelo DNA clonado. Proteínas expressas nestes sistemas constituem ferramentas úteis para desenvolvimento de métodos de imunodiagnóstico mais específicos.  Cada vez mais vem sendo desenvolvidos e disponibilizados novos e mais complexos vetores para expressão gênica, que não se restringem mais a organismos procarióticos, tais como na expressão de genes na bactéria Escherichia coli, amplamente usada há cerca de 10 anos atrás. Atualmente estão aumentando as publicações relatando novas técnicas de bioengenharia de células humanas e animais, para desenvolvimento de linhagens celulares com alta capacidade de produção de proteínas. A descoberta de novos suplementos para cultivos de células e novos sistemas de bioreatores de culturas celulares em larga escala está viabilizando a síntese de novos fármacos para quimioterapia humana e para terapias gênicas. Muitos destes sistemas de engenharia de células deverão em futuro próximo ser utilizados no desenvolvimento de insumos de diagnóstico e como ferramentas para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico

Também avançaram muito o desenvolvimento de novos softwares e novas ferramentas de bioinformática de uso público e de fácil acesso pela internet. Tem sido exponencial a geração e publicação de dados mundiais de sequencias de genomas, a maior precisão nas novas anotações de genomas e a descoberta de genes. Dados de seqüenciamentos deverão aumentar ainda mais rapidamente em decorrência da recente maior difusão e expectativa de redução de custos das nova plataformas de sequenciamento de DNA de nova geração, resultando em um enorme e constante avanço nos últimos anos que tem sido essenciais no aprimoramento do delineamento de métodos moleculares de diagnóstico.

A técnica de diagnóstico por PCR (reação de polimerase em cadeia) ou RT-PCR (transcrição reversa de genomas RNA e PCR) já é amplamente utilizada para diagnóstico de vírus e bactérias.  O teste se baseia na amplificação de cópias do genoma e tem como vantagem permitir o diagnóstico muito mais rápido do que o diagnóstico por isolamento ou cultivo do microrganismo. As suas vantagens são muitas, por permitir o rápido diagnóstico de microorganismos de mais demorado isolamento e identificação através de técnicas clássicas de virologia ou bacteriologia (isolamento, tipificação sorológica) e por não haver sequer a necessidade de que o vírus a ser identificado esteja viável. Mesmo amostras de vírus inativado ou tecidos fixados tem sido relatados como material viável para diagnóstico. O diagnóstico por PCR, por não requerer necessariamente o cultivo dos microrganismos, reduz riscos de biossegurança na manipulação de agentes infecciosos, especialmente no caso de agentes exóticos, a exemplo dos vírus de influenza e Newcastle patogênicos. 

Para padronizar um teste de PCR, ou PCR em tempo real, são utilizadas como referência as seqüências conhecidas do genoma do microorganismo suspeito a ser identificado.  Seqüências de amostras de inúmeros patógenos animais estão disponíveis em bancos de genomas e com base nestas seqüências são delineados primers, que são um dos componentes essenciais para especificidade e sensibilidade do diagnóstico. O essencial é conhecer bem o genoma do microrganismo para garantir que o teste reconheça apenas aquele patógeno e não resulte em reações cruzadas que confundam o resultado, ou para desenhar métodos capazes de detectar todos patógenos de uma mesmo grupo mas que tenham diferentes subtipos ou sorotipos.  Pode ser um grande desafio desenhar um método de PCR ou RT-PCR convencional, ou em tempo real, que seja sensível e consiga detectar com certeza todas as variantes de um mesmo vírus por exemplo.

O PCR em tempo real já é muito mais utilizado que o PCR convencional em muitos laboratórios de diagnóstico, pois permite detectar o produto do PCR à medida em que o DNA vai sendo amplificado na reação. Um dos métodos de PCR em tempo real mais aplicados em diagnóstico é o sistema conhecido como "Taqman", baseado na amplificação do genoma (RNA ou DNA) por PCR com dois pares de primers para síntese específica da seqüência a ser amplificada aliado ao uso de uma sonda, dirigida contra uma região interna da seqüência, que tem dois marcadores fluorescentes, um em cada extremidade da sonda. À medida em que a enzima Taq polimerase avança, sintetizando a fita nova de DNA, ela vai degradando a sonda à sua frente, liberando o fluorocromo e permitindo que este absorva energia e emita luz. A energia para a excitação dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra no equipamento de PCR em tempo real e, portanto, estes equipamentos são bem mais caros que os termocicladores de PCR convencional. O sinal resultante fornece o resultado da síntese ou não do DNA, determinando se o resultado é positivo ou negativo com altíssima sensibilidade e especificidade.  O refinamento recente dos sistemas de fluorocromos permite que sejam desenvolvidos testes conhecidos como "PCR multiplex" nos quais é feita a detecção simultânea de diferentes genomas. Por exemplo, diferentes segmentos de DNA subtipo-específicos de vírus de influenza poderiam ser testados em uma única reação. Os métodos multiplex são bem mais difíceis de padronizar e validar devido a competição interna de reagentes do teste e complexidades diferentes entre diferentes segmentos de genes, o que tem ainda limitado sua mais ampla utilização em diagnósticos de rotina ou diagnósticos oficiais.  O PCR em tempo real tem também a vantagem de poder ser utilizado também para quantificação de carga viral, ou seja uma titulação do vírus nas amostras testadas, o que é relevante por exemplo para titular rapidamente a excreção de vírus vacinal ou a redução de excreção de amostras virais de campo em aves vacinadas.  O PCR em tempo real tem também a vantagem de poder ser utilizado para quantificação de carga viral, ou seja, uma titulação do vírus nas amostras testadas.

Há inúmeras publicações de diversos métodos de PCR em tempo real para diagnóstico, incluindo o sistema "Taqman", mais usado em diagnóstico pela sua maior especificidade que outros métodos que utilizam fluorescencia intercalada com Sybr Green. Há também métodos que usam diferentes formatos de sondas, com princípios de funcionamento da reação um pouco distintos, tais como Molecular Beacons e Scorpion. Um formato diferente, denominado NASBA ("Nucleic acid sequencing-based amplification"), utiliza um diferente equipamento e não tem sido tão utilizado atualmente.  Bem mais recentemente foram introduzidos novos equipamentos de PCR em tempo real que realizam análises denominadas HRM ("High Resolution Melting"), que consistem em análises de alta resolução que permitem identificar no PCR em tempo real mutações pontuais, o que é muito útil no diagnóstico e identificação de variações entre diferentes organismos e poderá ser um método de análise cada vez mais aplicado também em diagnósticos.

O desenvolvimento e padronização de muitos métodos atualmente usados em diagnóstico tem sido possível nos últimos anos pelo constante aprimoramento de reagentes de diagnóstico desenvolvidos por empresas de biotecnologia e centros de pesquisa. Diferenças entre a qualidade e custos de reagentes e kits e insumos são um elemento essencial na garantia de reprodução e confiabilidade dos resultados e na avaliação de custo x beneficio da adoção de métodos moleculares de diagnóstico. Empresas que desenvolvem e comercializam no mercado internacional kits de diagnóstico e inúmeros reagentes usados em diagnóstico molecular tem continuamente melhorado a qualidade e performance de enzimas e meios usados, o que tem ampliado muito a adoção das técnicas de PCR e PCR em  tempo real. A maior confiabilidade e reproducibilidade de resultados que podem ser obtidas atualmente com estes métodos de diagnóstico e a ampliação da oferta de insumos e equipamentos no mercado internacional tem tornado cada vez maior a sua aplicação em laboratórios de diagnóstico. Contudo, em muitos países, como exemplo na América Latina o Brasil, estes diagnósticos moleculares tem ainda um custo maior que muitos outros métodos usados em rotinas de diagnóstico devido à dependência de importação da maior parte dos insumos e equipamentos de países da Europa e Estados Unidos para análises moleculares, sobre os quais incidem ainda altas de taxas de importação que variam muito em diferentes países e tornam o diagnóstico molecular mais ou menos acesível. 

A evolução no desenvolvimento de equipamentos usados em diagnóstico segue a tendência mundial de rápido desenvolvimento tecnológico em diversas áreas e tem resultado em grande inovação e cada vez maior qualidade e em muitos casos até a redução de custos de equipamentos agora empregados em larga escala tanto em pesquisa como diagnóstico. Exemplos recentes da grande evolução em equipamentos são as novas plataformas e metodologias de sequenciamento de nova geração, que já vem sendo usadas em analises genômicas em larga escala. Estes novos métodos já vem substituindo técnicas até recentes e ainda muito utilizadas para caracterização e tipagem de microrganismos, tais como sequenciamento por eletroforese capilar, análises de diversidade bacteriana por PFGE, ou a até poucos anos atrás muito utilizada análise de produtos de PCR com enzimas de restrição e  comparação de perfis de DNA.  Estes equipamantos permitem a análise de grandes genomas rapidamente.  A restrição atual para muitos laboratórios depequisa e aplicação imediata em diagnósticos de rotina é o custo dos equipamentoe (500 mil dólares) e insumos, assim como a demanda muito intenso de processamento de bioinformática que ainda deve evoluir mais para montar e solucionar os milhões de pequenos fragmentos de sequencias geradas. Há empresas que estão agora introduzindo no mercado equipamentos menores (em media 125 mil dólares) para menor volume de análises, aplicáveis ao sequenciamento de gnomas de vírus e bactérias e deverá ser apenas uma questão de tempo e demanda para que sejam incorporados a laboratórios de diagnóstico. Estes novos sistemaas, alem do maior volume de dados, tem uma grade vantagem sobre o seqüenciamento por PCR e eletroforese capilar uma vez que não é necessário desenha primers contra regiões conhecidas do genoma. Desta forma, permitem mais facilmente seqüenciar novas variantes ou a descoberta de novos microrganismos.

Exemplos de mais novas plataformas de Sequenciamento de Nova Geração:

-Roche/454  FLX (30): (http://www.454.com/enablingtechnology/the-system.asp)

Método "Ligase-mediated sequencing":

-Illumina/Solexa Genome Analyzer: (http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=203)

-SOLiDTM. Applied Biosystems http://marketing.appliedbiosystems.comhttp://images.engormix.com/Product/Solid

Método "Single molecule" sequencing":

-Helicos HeliscopeTM: " (www.helicosbio.com)

-Pacific Biosciences SMRT: "single molecule sequencers"  (www.pacificbiosciences.com)

Um dos exemplos de sequenciamento de nova geração: "Sequenciamento por síntese", em base sólida, sem necessidade de eletroforese.  Resumo da reação:

1)DNA fragmentado e ligado a adaptadores. 2) DNA de fita simples é ligado a uma superfície na células dos canais do seqüenciador. 3)adicionada enzima e nucleotídeos não fluorescentes e  iniciada a amplificação na fase sólida. 4)célula contendo "cluster" únicos de DNA, são adicionados os nucleotídeos fluorescentes, primers e polimerase, gerando a cópia do DNA de fita simples.  5) é emitido  o sinal fluorescente. 6) ciclos repetidos determinam a sequencia do DNA.  Referencia: Illumina''''s Solexa Sequencing Technology

Diagnósticos da doença de Newcastle e influenza aviária por RT-PCR e RT-PCR em tempo real validados por laboratórios internacionais de referencia de OIE tem sido recomendados pela OIE e FAO.  Um exemplo é o  diagnóstico de influenza é realizado pela amplificação do gene M dos vírus de influenza para detecção de quaisquer subtipos de influenza aviaria (influenza do grupo A), assim como testes específicos para os genes de hemaglutinina (HA) para diagnósticos dos vírus de influenza aviaria dos subtipos H5 e H7 (Spackman et al., 2004). Para Newcastle o teste é realizado pela amplificação do gene M dos paramyxovírus aviários do grupo 1 (APMV-1) para diagnóstico dos vírus da doença de Newcastle (Wise et. al, 2004; OIE - 2008).  Estes métodos, recomendados pela FAO e OIE, são atualmente utilizados nos diagnósticos moleculares em laboratórios de referência da maioria dos países que tem monitoramento0 oficial destas doenças. Apesar de sua alta sensibilidade e especificidade os métodos moleculares, por recomendação da própria OIE, requerem contínua avaliação de sua capacidade de detecção de novas amostras virais que podem emergir devido à alta variabilidade destes vírus.  O diagnóstico molecular pode ser considerado como um diagnóstico definitivo de muitas doenças de impacto econômico na produção e em programas de monitoria ativa, contudo para fins de notificação definitiva de surtos por amostras altamente patogênicas de agentes noticáveis, tais como os vírus de Newcastle e influenza aviária, ainda são exigidos pela OIE diagnósticos complementares, incluindo isolamento viral e testes de patogenicidade em aves SPF..

Há várias publicações científicas de outros diagnósticos por RT-PCR em tempo relatados como capazes de identificar a presença do vírus e ainda no mesmo teste diferenciar o subtipo patogênico e não patogênico, tais como para os subtipos H5 H7, pela utilização de primers específicos ao sítio de clivagem de HA, sem necessidade de execução posterior de sequenciamento de DNA. Contudo devido a variabilidade que pode ocorrer no sitio de clivagem dos vírus muitos métodos tem se retringido mais a pesquisa e requerem ainda maior validação para serem empregados em larga escala em rotinas de laboratórios de referência. A constante evolução dos vírus H5N1 asiático é um exemplo da dificuldade da adoção de quaisquer métodos sem a criteriosa verificação e adequação do teste para detectar novos vírus.  Portanto, nem todo método publicado na literatura científica é recomendado pela OIE se não tiver sido devidamente validado por laboratórios de referência internacional ou centros colaboradores da OIE.

Há testes de PCR em tempo real recomendados pela OIE que foram validados com pontos de corte que garantam a maior sensibilidade do teste, em detrimento da especificidade, para garantir a detecção de amostras positivas, o que pode resultar em maior numero de amostras suspeitas ou falso positivas, requerendo novas coletas de amostras ou confirmação dos resultados por métodos complementares. Portanto, apesar dos grandes avanços no diagnóstico molecular, é importante considerar que qualquer método de diagnóstico requer constante verificação e deve ficar clara a definição de propósito do teste - monitoria ativa ou diagnóstico de indivíduo ou população, definição do grau ideal de sensibilidade e especificidade. Especialmente nos casos de enfermidades notificáveis, estes aspectos da padronização de qualquer método diagnóstico são levados em consideração, requerendo, portanto, a utilização de métodos de diagnóstico devidamente validados e sujeitos a constante verificação de adequação a novas situações epidemiológicas.

A presença de aminoácidos básicos no sítio de clivagem da proteína HA dos vírus de influenza aviária é característica de vírus altamente patogênicos e é oficialmente reconhecido pela OIE como método de determinação da patogenicidade do vírus. A análise por RT-PCR seguida de sequenciamento do gene HA para diagnóstico e caracterização de cepas patogênicas e não patogênicas dos vírus de influenza aviária pode ser usada como mais uma alternativa aos testes de isolamento, tipificação sorológica e testes de patogenicidade in vivo em galinhas. Portanto, testes moleculares tais como RT-PCR em tempo real ("Real-time RT-PCR") e RT-PCR associado a sequenciamento de DNA são ferramentas de diagnóstico que vêm sendo utilizadas no diagnóstico e nas investigações epidemiológicas dos surtos de influenza.. A análise filogenética com base no sequenciamento de diferentes genes de vírus de influenza é o método padrão utilizado no mundo atualmente para rastreamento das possíveis espécies e regiões de origens de vírus de influenza isolados, assim como predição da evolução genética de novos vírus, sendo essencial para análises epidemiológicas e análises de risco de introdução e disseminação de vírus de influenza em diferentes espécies animais.  Sequenciamos na Embrapa Suinos e Aves o genoma completo (todos 8 segmentos do genoma, de cerca de 15 Kb), de duas amostras de influenza aviária (H2N3 e H4N6) isoladas de aves aquáticas nos anos de 2004-2005  estamos finalizando o sequenciamento do genoma de outras 9 amostras (H3N8, H2N3, H4N6). Os resultados até agora obtidos, a serem publi8cados, demonstram maior identidade dos vírus H2N3 e H4N6 analisados com amostras européias isoladas há mais de  40 a 50 anos, o que indica circularem no Brasil vírus com origem em linhagens da Eurásia e não de linhagens americanas predominante na America do Norte e Central. Será importante aumentar a amostragem e coletas de aves aquáticas e migratórias para uma mais compreensiva analise e compreensão da epidemiologia de influenza aviária no Brasil.

A técnica de seqüenciamento de fragmento de DNA do gene da hemaglutinina (HA) que flanqueia o sitio de clivagem do gene F do vírus da doença de Newcastle pode ser utilizado para determinar a patogenicidade dos vírus pela presença de seqüência de nucleotídeos que codificam múltiplos aminoácidos básicos nestas regiões de clivagem é um indicador bem estabelecido de patogenicidade e aceito para fins de diagnóstico (OIE, 2008).  Contudo, de acordo com normas publicadas no manual da OIE (OIE, 2008), para confirmar um resultado negativo para influenza aviária e doença de Newcastle ainda é considerado necessário realizar o isolamento do vírus para executar testes de patogenicidade in vivo (pela inoculação de aves SPF), uma vez que não é descartada a possibilidade de ocorrerem infecções mixas com diferentes vírus de baixa e alta patogenicidade não identificados no seqüenciamento de DNA.  O seqüenciamento de mais de 40 amostras de vírus da doença de Newcastle isoladas pelo Lanagro-SP/Ministerio da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Campinas Brasil, entre 1999 a 2009 tem também oferecido importantes dados sobre os vírus de Newcastle no Brasil, identificando-se ate o momento apenas vírus de genótipos predominante nas Américas e genótipos vacinais ou baixa patogernicidade (dados ainda não publicados). O seqüenciamento de DNA para determinar a patogenicidade de amostras isoladas de Newcastle é uma metodologia aplicada na rotina de diagnósticos oficiais do Lanagro-SP no Brasil.

Mesmo um excelente e avançado método de diagnóstico molecular depende também da qualidade da amostra. A primeira etapa, realizada antes da reação por PCR, consiste na eficiente extração do RNA de swabs ou órgãos coletados e para tanto são necessário métodos que garantam a integridade do DNA ou RNA.  A coleta do material das aves deve ser executada de  forma o mais limpa e estéril possível, seguida de imediata refrigeração para prevenir a ação de nucleases e proteases, que são enzimas presentes nas células e que degradam proteínas, DNA celular e RNA. 

Existem inúmeros protocolos de extração de RNA, aplicados conforme os tipos de órgãos e tecidos utilizados para o diagnóstico, utilizando-se diferentes tampões, detergentes e enzimas para o processo de extração de ácidos nucléicos. Alguns órgãos apresentam maiores dificuldades na qualidade do DNA e RNA extraídos, o que pode interferir na qualidade do resultado de RT-PCR.  O fígado, timo e baço são órgãos muito ricos em ácidos nucléicos e em endonucleases. O fígado contém glicogênio que é um contaminante que inibe a reação de PCR e o cérebro é rico em proteínas e gorduras que interferem na eficiência da extração. Fezes e swabs de cloaca são um material que oferece maiores dificuldades para diagnóstico por RT-PCR e para isolamento viral pela contaminação bacteriana da flora intestinal aumentando proteases e nuclease que degradam a amostra.  No caso de aves silvestres os suabes de cloaca são mais freqüentemente o único material disponível para diagnóstico e monitoria de infecções, pois se evita sacrificar as aves. Portanto é essencial avaliar e usar um método que seja mais eficiente na redução destes fatores que interferem no PCR. Sistemas de automação para extração de RNA e desenvolvimento de novos métodos e de kits, tais como os baseados em captura magnética de ácidos nucleicos, incrementaram enormemente nos últimos anos a qualidade de RNA extraído de órgãos e suabes de aves e é método ais facilemtne automatizado, tornando-se um dos métodos mais utilizados atualmente em laboratórios de diagnóstico com grande volume de análises. A automação da extração de ácidos nucleicos já é considerada essencial para a área de diagnóstico molecular uma vez que reduz a variabilidade de resultados em comaparação a métodos manuais. Há no mercado vários equipamentos de automação dos processos de extração, a maioria baseados nas novas metodologias de captura magnética de DNA ou RNA, ou em microcolunas.

Alguns exemplos de equipamentos comercializados por representantes no Brasil, entre estes alguns que já utilizamos com excelentes resultados: Sistema Mag Max, da empresa Applied Biosystems/LifeTechnologies; Magna Pure LC, da Roche; EasyMag, da BioMérieaux, EZ1 Advanced XL ou BioRobot M48 Workstation da marca Qiagen; King Fisher Flex, da Thermo Fisher Scientific; Maxwell® 16 Research System, da Promega e muitos outros. Os equipamnetos variam quanto ao número de amostras testadas, grau de automação de todas etapas de extração, custos de manutenção, custos de kits, flexibilidade , que devem ser avaliados conforme as caracteristicas de uso, demanda e custos para os laboratórios.

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