Salmonella sp ovos galinha

Introdução

Diante da problemática da presença da Salmonella sp. nos ovos e a importância disto para a saúde pública, é preciso implementar medidas de controle eficazes, destinadas a garantir a segurança dos alimentos para o consumo humano (Berchiere, 2000). Neste contexto, destacamos a importância de procurar novas tecnologias que tenham rapidez nos resultados, alta sensibilidade e baixo custo para a detecção desta bactéria.

A Reação de Cadeia da Polimerase-PCR parece ser uma estratégia útil para a detecção de bactérias do gênero Salmonella em diferentes substratos como carnes, sangue, leite e ovos. Para o uso da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase é essencial a obtenção de DNA de boa qualidade para assim conseguir bons resultados nos testes em que os excessos de estruturas celulares e proteínas podem inibir o processo de amplificação. As extrações de DNA devem proporcionar uma boa padronização nas bandas, com quantidade e qualidade suficiente para não causar interferência nos padrões de migração de géis de eletroforese.

Isso indica que novos protocolos ainda precisam ser testados para diferentes substratos, com o objetivo de desenvolver novas tecnologias e, inclusive, melhorar os já existentes. Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de três métodos para a extração do DNA da Salmonella sp. em ovos de galinhas livres de patogênicos específicos (SPF).

Materiais & Métodos

As amostras de Salmonella sp e Escherichia coli foram liofilizadas no Laboratório de Estudos em Sanidade Avícola da Universidade Federal de Viçosa. Estas bactérias foram ativadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI), a 37ºC, por 18 horas.

Foram utilizados 75 ovos brancos de galinhas livres de patogênicos específicos (SPF), que foram divididos em 5 grupos, com 15 ovos cada um. Os ovos foram inoculados na cavidade alantoidiana: inicialmente, cada ovo foi desinfetado com uma solução de tintura de iodo a 10% no lugar da perfuração da casca, a seguir os ovos foram perfurados na câmara de ar, com a ajuda de uma agulha de aço inoxidável adaptada a uma borracha de calibre 30 x 12 mm. Os ovos foram inoculados com uma seringa de tuberculina de 1ml, 0,1ml. Os ovos foram inoculados com cultivos bacterianos, três grupos desses foram inoculados com Salmonella sp. a uma concentração de 10⁵ UFC/ml, outro grupo foi inoculado com uma linhagem de E. coli na mesma concentração que os anteriores e os ovos do grupo controle foram submetidos aos mesmos procedimentos, usando-se solução salina a 0,85%, tampada e esterilizada. Para fazer a inoculação, foi utilizada uma agulha de calibre 12,7 X 0,33 mm que foi introduzida na câmara de ar, colocado o conteúdo na cavidade alantoidiana, num ângulo aproximado de 30°. Depois da inoculação os orifícios foram selados com cola, e os ovos foram transferidos a bandejas, onde permaneceram por 24 horas a temperatura ambiente.

Depois deste tempo as gemas de cada grupo foram recolhidas assepticamente e colocadas num beaker estéril e homogeneizado. A seguir se trasladaram 10ml do homogeneizado de gema aos tubos de centrífuga. Foram centrifugados 2.500 x g a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e os sedimentos foram suspensos outra vez em igual volume com PBS pH 7,2. e centrifugados, novamente eliminado o sobrenadante. O sedimento obtido de cada grupo foi armazenado a -20°C, até a extração do DNA.

A extração do DNA bacteriano com o kit comercial- GenElute Bacterial Genomic ADN (Zigma^®) se realizou segundo as instruções do fabricante. O DNA obtido foi quantificado e analisado em gel de agarosa (1%); ele foi tingido com brometo de etídio e visualizado com luz ultravioleta.

Os dois outros protocolos que utilizaram partículas de sílex com DNAzol ou NaI foram baseados no trabalho de Boom et al. (1990).

Foram adicionadas 600 µL de NaI (ou Dnazol) às amostras, aquecidas a 55°C e agitadas suavemente por cinco minutos. O material obtido foi centrifugado por 5 minutos a 12.000 x g a temperatura ambiente e o sobrenadante foi coletado com ajuda de uma pipeta. A continuação, foi agregado à mescla 50 μl de suspensão de sílex (dióxido de silício- Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) e foi homogeneizada com um vórtex. A mescla foi incubada num agitador end-over-end (Speci-Mix, Thermolyne) por 10 minutos à temperatura ambiente, depois se centrifugou por 30 segundos a 12.000 x g à temperatura ambiente, se descartou o sobrenadante por inversão do tubo. O sedimento foi enxaguado duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem (50%, 50mM Tris-HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8). Depois da centrifugação por 30 segundos a 14.000 x g à temperatura ambiente, todo o tampão de lavagem foi removido com uma pipeta.

Logo após, adicionou-se 1 ml de acetona e foi homogeneizado no vórtex e centrifugado por 30 segundos a 14.000 x g à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o resíduo de acetona se evaporou do sedimento pelo tubo, com tampa aberta a una temperatura de 56°C, durante 10 minutos. O DNA aderido ao sílex foi eluído por adição de 50 μl de TE (5 mM TRIS-HCl pH 8, 0,5 mM EDTA pH 8), incubado a 50°C por 5 minutos e centrifugado por 30 minutos a 14.000 x g à temperatura ambiente, para solidificar o sedimento. O sobrenadante foi retirado com uma pipeta, as amostras de DNA foram extraídas, analisadas e quantificadas por leitura em espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), que estima a quantidade de DNA da amostra em μg/ μl e a quantidade do material pelo valor obtido na razão DO260nm/ DO280nM.

Com as alíquotas de cada amostra de DNA, obtidas a partir dos dois protocolos de extração, realizaram-se as reações de amplificação, com um volume final de 50 µL que continha: 2µL de DNA, 5 µl de tampão 10X ( 200mM Tris-HCl, pH 8, 500mM KCL- Invitrogen^®) 1,0 µL de DNTP a 10mM ( Datp, dTTP, Dctp, Dgtp - Invitrogem), 1,5 µL de MgCl2 a 50 mM, 1µL de cada primer a 25 pmol , 0,3µL Taq polimerase a 1U/µL e água ultrapura q.s.p.

O par de primers para a amplificação do DNA foi sintetizado com base na sequência: 5' GTA AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA 3' (primer 1) e 5' TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 3' (primer 2), para amplificar um fragmento de 284 pares de base do gene invA de Salmonella sp. A reação PCR foi realizada com todas as amostras das extrações em termociclador. As condições de amplificação foram de um ciclo inicial de desnaturalização a 94°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalização a 94°C, durante 30 segundos, aquecido a 60°C durante 30 segundos e logo após se aumentou a temperatura a 72°C por 30 segundos e, por ultimo, se aumentou a temperatura a 72°C durante 7 minutos. A detecção dos produtos de PCR se realizou por eletroforese em gel de agarosa a 1%. Como marcador de peso molecular se utilizou um DNA ladder de 100pb (GibcoBRL). A visualização foi realizada mediante um transiluminador UV.

Resultados & Discussão

Apesar de ter sido possível a extração do DNA bacteriano através dos protocolos em que foram utilizadas as partículas de sílex junto ao reativo DNAzol ou Nal, estas reações não foram as desejadas. As amostras apresentaram valores inferiores a 1,8, o que indica contaminação do DNA por proteínas. Por isso, é preciso ajustar o protocolo de extração.

Quanto ao kit comercial - GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Zigma^®), não foi possível visualizar a amplificação do DNA nas amostras extraídas. No entanto, foi possível visualizar a amplificação de todas as amostras obtidas nos três protocolos por PCR. Foram utilizados os primers derivados do gene invA, obtendo uma banda de amplificação de DNA com 284 pares de bases, como o esperado em todas as amostras da Salmonella sp., não sendo observada nenhuma amplificação do DNA de E. coli. Com isto podemos afirmar que o gene invA Salmonella sp. contém sequências únicas e demonstrou que este gene é um objetivo adequado para PCR, com possíveis aplicações em diagnósticos de Salmonella sp.

O melhor resultado foi obtido quando o DNA foi extraído através de partículas de sílex com Nal, pela presença de bandas mais intensas de DNA, indicando maior representação de material genético (Figura 1). Portanto, a extração de DNA por este método pode ser utilizada de maneira segura nos testes de PCR, reduzindo assim os custos da técnica, principalmente no que se refere à aquisição de kits de extração do DNA.

Rahn et al., (1992), usando um par de oligonucleotídeos do gene invA, conseguiram detectar 626 linhagens de Salmonella em 630 testes, a partir de uma colônia isolada e incorporada diretamente ao PCR. Eles obtiveram uma sensibilidade de 99,4% e uma especificidade de 100%, pois não observaram uma reação positiva em nenhum controle negativo pertencente a outras 33 enterobactérias avaliadas.

Segundo Rohland & Hofreiter (2007), o método de extração utilizando partículas de sílex tem algumas vantagens sobre outros protocolos, já que é rápido e fácil, e pode ser utilizado em pequenas quantidades da amostra. Além disso, é muito fácil de implementar, já que utiliza um equipamento padrão de laboratório e poucos produtos químicos. Por outro lado, possui uma eficiente remoção de inibidores para PCR

Figura 1. Padrão eletroforético dos produtos amplificados por PCR de DNA da Salmonella sp, extraídos pelos métodos de partículas de sílica com DNAzol^® e NaI

Avaliação de três métodos de extração de dna de Salmonella sp em ovos de galinha contaminados artificialmente - Image 1

M: marcador de peso molecular de 100pb ; EC: amostra de E. coli; SO,S1,S2,S3 amostras de Salmonella sp; C+: controle positivo de um cultivo de Salmonella sp; DNAzol DD: controle negativo; B: Branco.

Conclusão

O protocolo que utiliza as partículas de sílex permite a extração e a obtenção do DNA genômico de Salmonella sp de boa qualidade, integridade e adequado para a amplificação.

Bibliografia

Berchiere Junior A. 2000. Salmoneloses aviárias. pp. 185-195. In: Doenças das Aves. Berchiere Junior A, Macari M (ed.). FACTA, Campinas, Brasil.

Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen PM, Wertheim PME, Noordaa JVD. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503.

Rohland N & Hofreiter M. 2007. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nature Protocols 2:1756-1762.

Rhan k, De Grandis SA, Clarke RC, McEwe SA, Galán JE, Ginocchio C, Curtis R, Gyles CL. 1992. Amplification of invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cel. Probes 6:271-279.

Salmonella sp ovos galinha

Avaliação de três métodos de extração de dna de Salmonella sp em ovos de galinha contaminados artificialmente

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