Pasteurella multocida pintinhos

Pasteurella multocida é o agente etiológico do Cólera Aviário. Além disso, P. multocida pode ser tanto um agente patogênico primário, como um agente secundário associado a outras doenças. A apresentação desta doença pode ser aguda, subaguda ou crônica. A apresentação aguda ou subaguda está associada com septicemia e alta mortalidade, enquanto que os casos crônicos estão associados a infecções locais em barbilhões, seios paranasais, peritôneo, fígados, pulmões ou ovários (Boyce et al., 2004). Nos casos crônicos de Cólera Aviário, as aves costuma permanecer  como portadoras e sofrem redução da produção de ovos, enquanto que nas aves reprodutoras, a doença causa também diminuição da fertilidade. A patogenicidade depende da linhagem isolada, do hospedeiro e de seu estado sanitário (Glisson et al., 2008). Entre os fatores de virulência conhecidos é relevante mencionar a cápsula, os LPSs, as toxinas, o sistema de aquisição de ferro, as adesinas e outras proteínas de membrana. No entanto, a participação de cada um destes fatores não está totalmente esclarecida (Boyce et al., 2010).

Pasteur (1880) foi o primeiro em descrever a diminuição da patogenicidade de P. multocida, após passagens em meios de cultivo artificiais e sua posterior recuperação após passagens ao vivo. Portanto, não é possível reproduzir o Cólera Aviário sem antes estabelecer a dose adequada de inoculação. Embora estejam descritas algumas linhagens altamente patogênicas (Chung et al., 2001; Harper et al., 2007), há diferentes descrições sobre a patogenicidade de isolamentos locais de P. multocida.

O objetivo deste trabalho é conhecer a patogenicidade de isolamentos locais de linhagens de P. multocida para predizer sua capacidade de causar mortalidade e estabelecer um modelo padrão de reprodução experimental do Cólera Aviário adequado para avaliar tratamentos preventivos ou curativos.

Materiais & Métodos

Aves
Pintos machos de poedeiras, de 1dia de vida, da linha Hisex brown. Linhagem de Pasteurella multocida.
Foram utilizadas 10 linhagens regionais de P. multocida do Laboratório de Bacteriologia do INTA EEA Balcarce (Tabela 1).

Tabela 1. Linhagens de Pasteurella multocida

Inóculo
As linhagens foram extraídas de ampolas congeladas em nitrogênio líquido e semeadas sobre Agar Base Columbia, com 7% sangue bovino (ASC). Foram incubadas durante 18 horas a 37ºC e, de cada placa, se transferiu uma colônia a 10 ml de caldo infusão cérebro coração. Este caldo foi incubado durante 18 horas a 37ºC e foi diretamente utilizado para inocular as aves.

Desenho Experimental
Ensaio 1: De cada uma das linhagens foram injetadas, por via subcutânea, 0,1 ml do inóculo desenvolvido em caldo infusão cérebro coração em 5 pintos de 2 dias de vida. A mortalidade foi registrada às 24 horas pós-inoculação. Foram extraídos os fígados dos pintos mortos ou sacrificados (na proporção de 2 pintos por cada linhagem), mediante deslocamento cervical (AVMA, 2007). Os dois fígados de cada lote foram macerados manualmente em bolsas plásticas em PBS (pH 7,2) e semeados em ASC e Agar Base para novo isolamento de P. multocida e Agar MacConkey para controle de possíveis enterobactérias contaminantes.

Ensaio 2: De cada uma das linhagens, foram injetadas em 5 pintos de 3 dias de vida, por via subcutânea, 0,1 ml do macerado dos fígados obtidos no Ensaio 1. A mortalidade foi registrada às 24 horas pós-inoculação, sacrificando todas as aves que sobreviveram. Foram extraídos todos os fígados dos pintos mortos ou sacrificados em cada lote. Os fígados foram macerados e semeados em forma similar à descrita no Ensaio 1. Agrupando, em conjunto, os fígados de cada lote de aves, foram feitas contagens de cada macerado através da técnica de Miles e Misra (1938) sobre placas de ASC.

Ensaio 3: Foram selecionadas as 5 linhagens que causaram mortalidade ou septicemia nos ensaios anteriores. Estas 5 linhagens foram inoculadas em 10 pintos de 4 dias de vida, por via subcutânea, utilizando 0,1 ml do macerado dos fígados de cada lote que havia sido obtido no Ensaio 2. A mortalidade foi registrada  às 24 pós-inoculação e foram sacrificadas todas as aves que sobreviveram. Foram extraídos os fígados dos pintos mortos ou sacrificados. Os fígados foram semeados em forma similar à descrita para o Ensaio 1.

No Ensaio 1, usando os inóculos do caldo infusão cérebro coração, provenientes das linhagens extraídas de nitrogênio líquido, somente se observou mortalidade nos Grupos 1 e 9 (respectivamente em 1 ave de 5 e em 2 aves de 5) (Tabela 2).

No Ensaio 2, realizado mediante a utilização do macerado dos fígados provenientes do Ensaio 1 como inóculo, houve mortalidade nos mesmos dois grupos anteriores (1 e 9). Por outro lado, foi isolado  P. multocida em cultivo puro dos macerados dos fígados de Grupos 8 e 10, embora esta bactéria não tenha causado mortalidade. Além disso, foram encontradas 2 aves mortas por causas alheias ao ensaio do Grupo 4, mas sem conseguir o isolamento de P. multocida no macerado. 

No Ensaio 3 foram utilizados somente 5 linhagens que foram selecionadas por sua aparente patogenicidade: 3 linhagens que causaram mortalidade (Grupos 1, 4 e 9) e 2 linhagens que causaram infecção hepática, embora sem produzir mortalidade (Grupos 8 e 10). O ensaio foi realizado através da injeção subcutânea de 0,1 ml do macerado dos fígados do Ensaio 2, contendo aproximadamente 10⁷ unidades formadoras de colônias por ave de P. multocida em cultivo puro. A mortalidade registrada nos Grupos 1 e 9 foi de 100 %, enquanto que nos outros 3 grupos inoculados somente 1 pinto morto foi encontrado no Grupo 10. P. multocida foi isolada dos 5 pools de fígados.

Tabela 2. Inóculos e mortalidade de Pasteurella multocida

Todas as linhagens regionais utilizadas foram isoladas de casos clínicos de Cólera Aviário e conservadas congeladas em nitrogênio líquido durante vários anos. De acordo com os primeiros trabalhos de Pasteur (1980), os resultados obtidos no presente trabalho mostraram um aumento da patogenicidade de algumas das linhagens de P. multocida estudadas. Assim se demonstrou que, após duas passagens ao vivo, a mortalidade no Grupo 1 (linhagem 1019) aumentou de 20% a 100% e, no Grupo 9 (linhagem 2088) de 40% a 100. No entanto, algumas das linhagens estudadas mostraram capacidade de invasão dos fígados, embora só fossem capazes de causar mortalidade baixa ou nula. Estas últimas linhagens estavam geralmente associadas a casos crônicos de Cólera Aviário, gerando perdas por baixa produção e fertilidade, mas sem causar mortalidade nas granjas. No entanto, existe a possibilidade de que, se tivessem sido efetuados um maior número de passagens ao vivo, estas mesmas linhagens poderiam ter aumentado sua patogenicidade.

Foi conhecida a patogenicidade de linhagens autóctones de P. multocida  e observadas mudanças de virulência depois de duas passagens ao vivo. Estes resultados trazem informação para estabelecer um modelo padrão de reprodução experimental do Cólera Aviário, para avaliar linhagens regionais.

 

 

Boyce JD, Lo RYC, Wilkie I, Adler B. 2004. Pasteurella and Mannheimia. pp. 385-396. En Pathogenesis of bacterial infections of animals, Gyles CL, Thoen CO, Prescott JF, Songer JG (eds.). Blackwell Publishing Ames, IA, USA.

Boyce JD, Harper M, Wilkie IW, Adler B. 2010. Pasteurella. pp. 325-346. En Pathogenesis of Bacterial Infections En Animals 4^th ed, Gelyes CL, Prescott JF, Songer JG, Thoen CO, Blackwell publishing Ames, IA, USA.

Chung JY, Wilkie I, Boyce JD, Townsend KM, Frost AJ, Ghoddusi M, Adler B. 2001. Role of Capsule in the Pathogenesis of Fowl Cholera Caused by Pasteurella multocida Serogroup A. Infect Immun 69:2487-2492.

Glisson JR, Hofacre CL, Christensen JP. 2008. Pasteurellosis and Other Respiratory Bacterial Infection: Fowl Cholera. pp. 739-758. En Diseases of poultry 12^th ed, Saif YM, Fadly AM, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Swayne DE. Blackwell publishing, Ames, IA, USA.

Harper M, Cox A, St. Michael F, Parnas H, Wilkie I, Blackall PJ, Adler B, Boyce JD. 2007. Decoration of Pasteurella multocida Lipopolysaccharide with Phosphocholine Is Important for Virulence. J Bacteriol 189:7384-7391.

 

 

Pasteur L. 1880. De l''''atténuation du virus du cholera des poules. CR Acad Sci. 91:673-680.