kit FluoroQuant aflatoxina Performance

O kit de teste FluoroQuant® Afla Plus para testes de aflatoxina recebeu status de Performance TestedSM pela AOAC

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As aflatoxinas são um grupo de compostos relacionados quimicamente que são importantes micotoxinas hepatotóxicas. Elas são produzidas por fungos e podem contaminar culturas importantes, incluindo milho, amendoim, nozes e castanhas, sob condições ambientais favoráveis.

Estas toxinas podem causar doenças no fígado de seres humanos e animais, diminuição na produção de leite e ovos, além de serem imunossupressoras, carcinogênicas e mutagênicas.

A aflatoxina de ocorrência mais comum, e a mais potente dentre elas, é a Aflatoxina B1. Os principais fungos associados com a produção das aflatoxinas são o Aspergillus flavus e o Aspergillus parasiticus, sendo que o segundo é particularmente importante na contaminação de amendoins. Temperaturas mais quentes e condições secas fazem com que o grão se torne mais suscetível à formação de aflatoxinas no campo. Além disso, danos causados por insetos permitem que o organismo acesse sementes isoladas, aumentando assim a chance de contaminação por aflatoxina em uma cultura infestada. As toxinas podem também se formar sob más condições de armazenamento, quando os grãos são mantidos a alta temperatura, ambiente com alta umidade ou são secos de forma inadequada.



Figura 1: Estrutura da Aflatoxina B1

As concentrações de aflatoxina são geralmente medidas quantitativamente, usando-se tecnologia ELISA, CLAE ou kits de testes fluorimétricos.

A tecnologia ELISA geralmente requer períodos longos de incubação, analistas experientes e é mais vantajosa para a análise de lotes de amostras que para amostras simples. A CLAE requer equipamentos caros e analistas muito bem treinados. Além disso, muitos métodos aprovados de CLAE ou métodos de CLAE usados e estudos colaborativos exigem períodos longos de limpeza ou análise da amostra. Os kits de testes fluorimétricos têm a vantagem da velocidade e facilidade de uso, além de serem aplicáveis a testes de amostras únicas. Essas são qualidades altamente desejáveis em um ambiente em que amostras únicas ou um número pequeno de amostras deva ser testado rapidamente.



O FluoroQuant® Afla Plus é um kit de testes fluorimétricos aperfeiçoado, que recebeu status de Performance TestedTM pela AOAC. O kit emprega uma coluna de limpeza de fase sólida e estágio único, seguida por análise fluorimétrica, para determinar aflatoxinas em milho, amêndoas e amendoins. A extração usa acetonitrila/água ou metanol/água (opcional para amendoins). Este método quantitativo é rápido, preciso, barato e pode ser aplicado a amostras individuais. É simples o suficiente para que seja usado em instalações de processamento, instalações de manuseio de rações e alimentos e terminais de exportação. É também adequado para uso em laboratórios analíticos.

O método é direto e simples de usar. Primeiro, coleta-se uma amostra, certificando-se de que seja tomada uma amostra representativa do lote. A amostra é triturada, e uma porção de 50g é colocada em uma jarra de liquidificador. Milho, amendoins e amêndoas são extraídas com acetonitrila/água a 86/14.

Opcionalmente, para amendoins, metanol/água a 80/20 também pode ser usado no lugar de acetonitrila/água. As amostras são processadas por 1 minuto e filtradas para um recipiente de vidro ou polipropileno. A partir deste extrato, 2ml de amostra são colocados em uma coluna de limpeza SolSep® 2001, incluída com o kit de teste FluoroQuant® Afla Plus.

Se a opção de extração com metanol tiver sido usada para amendoins, 1ml de amostra e 1ml de diluente são adicionados à coluna e misturados com a ponta da pipeta. As amostras são então forçadas pela coluna, e uma porção de 1ml do extrato purificadoé colocada em uma cuveta limpa. Adiciona-se 1ml de reveladorà amostra purificada, que é misturada por turbilhonamento e colocada em um fluorímetro calibrado. O fluorímetro apresenta o resultado em ppb, após um período pré-programado.

O método é muito rápido e pode ser concluído em cinco minutos ou menos, incluindo a extração.



Status de Performance TestedSM da AOAC

O teste de desempenho por uma organização internacional e independente oferece aos consumidores a confiança de que um terceiro independente avaliou um produto e achou que ele está de acordo com suas declarações de desempenho. O AOAC Research Institute é uma organização científica sem fins lucrativos que oferece testes de desempenho para métodos analíticos reconhecidos internacionalmente. Eles servem como terceiro independente, e concedem o status de Performance TestedTM aos kits de teste avaliados e considerados de acordo com suas declarações. Para atingir o status de Performance TestedTM, a Romer Labs® realizou um estudo interno de validação e enviou um relatório de validação embasando as declarações de desempenho do kit de teste FluoroQuant® Afla Plus a um perito geral, especialista no campo de análise de micotoxinas. O perito geral distribuiu o relatório a um grupo de especialistas de base internacional, para análise.

Os kits foram enviados também a um laboratório analítico independente, aprovado pela AOAC-RI, para teste. O perito geral e os especialistas analisaram então o relatório de validação e os resultados do teste do laboratório independente, antes de conceder ao kit o status de “Performance TestedTM”

Programas de validação de método da AOAC

A AOAC oferece três programas de validação - Official MethodsSM (métodos oficiais), Peer-Verified MethodsSM (métodos verificados pelos colegas) e Performance TestedSM Methods (métodos com desempenho testado).

O programa Official MethodsSM da AOAC valida e aprova métodos exclusivos e não exclusivos. Um método aprovado por este programa foi testado usando-se um amplo estudo colaborativo multilaboratorial, usando pelo menos 8 a 10 laboratórios independentes.

Há dois Métodos Oficiais que usam produtos da Romer Labs® para detecção de aflatoxina: métodos 994.08 (“Aflatoxinas em milho, amêndoas, amendoins, castanhas- do-pará e pistache”), que é um método de CLAE que usa colunas MycoSep 224, e 993.16 (“Aflatoxinas totais (B1, B2 e G1) em milho”), o método AflaCup 20.

O programa Peer-Verified MethodsSM oferece uma validação de terceiro independente para métodos não-exclusivos.

Estes métodos não passaram por um estudo colaborativo completo, mas seu desempenho foi verificado por pelo menos um laboratório independente. Este programa pode também ser um ponto de entrada para o Official Methods ProgramSM, já que muitos desses métodos são depois apresentados para estudos colaborativos completos.

O programa Performance Tested MethodsTM é administrado pelo Instituto de Pesquisa da AOAC, uma subsidiária da AOAC International. Este programa oferece uma validação de terceiro independente para métodos comerciais exclusivos (kits de teste). O desempenho destes métodos foi verificado por pelo menos um laboratório independente.

O status de ter o desempenho testado assegura aos usuários que os kits de teste foram validados, avaliados por um terceiro independente e tem desempenho conforme declarado. Uma declaração, confirmando que o kit não foi alterado, deve ser enviada à AOAC anualmente, quando a aprovação é renovada. Se o kit for alterado, a AOAC deve ser notificada sobre a alteração, e podem ser necessários testes adicionais. Estes métodos podem também ser posteriormente apresentados para estudos colaborativos completos no .Official Methods ProgramTM. O kit de teste FluoroQuant® Afla Plus para testes de aflatoxina foi aprovado como Performance Tested Method em março de 2007.



Validação do FluoroQuant® Afla Plus

Para verificar o desempenho do kit, a Romer Labs® conduziu um estudo de validação no qual amostras de milho naturalmente contaminado e perfurado e amostras perfuradas de amêndoas e amendoins crus foram analisadas em vários lotes de kits, por um período de vários dias.

Os resultados foram comparados a um método de referência de CLAE estabelecido. Além disso, a estabilidade e a robustez do método do kit de teste foram examinadas.

Para determinar o LOD, dez amostras de cada produto não detectado foram extraídas e analisadas de acordo com o método do kit de testes. O LOD foi determinado como a média mais duas vezes o desvio padrão. O LOD do kit variou com o produto, e verificou-se que é de 1,9 ou menos para todos os produtos testados, conforme apresentado na Tabela 1.

Para testar a exatidão e a precisão do kit de testes, amostras naturalmente contaminadas de milho e amostras fortificadas de milho, amendoins e amêndoas foram testadas de acordo com o método do kit.

Vinte e uma amostras individuais de milho de material naturalmente contaminado, para cada nível de aflatoxina, foram extraídas e analisadas por três analistas, que não conheciam o nível do analito. Além disso, cinco cópias de cada nível fortificado de milho, amendoins e amêndoas foram analisadas por três analistas, usando o kit.



O kit demonstrou uma atuação muito boa em milho naturalmente contaminado com aflatoxinas, no intervalo de não-detecção a 100ppb. Todos os resultados médios caíram dentro de intervalos aceitáveis, e pelo menos 95% dos resultados individuais caíram dentro do intervalo.

Os resultados do kit de teste concordaram bem com os resultados do método de CLAE.

As recuperações de amostras fortificadas variaram de 84 - 92%. O kit também apresentou atuação muito boa em amendoins e amêndoas fortificadas com aflatoxina. Todos os resultados médios caíram dentro de intervalos aceitáveis, e 100% dos resultados individuais caíram também dentro do intervalo. As recuperações de amostras fortificadas variaram de 85 – 115%.

A incerteza de medição para milho foi de ±2ppb para 5ppb, ±5ppb para 10ppb, ±6ppb para 20ppb e ±21ppb para 100ppb, com um intervalo de confiança de 95%.

A robustez e a estabilidade dos kits também foram testadas. O kit apresentou bons resultados para alterações na temperatura ambiente, variações no tempo de extração, idade do extrato, tempo de limpeza e idade do revelador.


Tabela 1: LODs de produtos validados

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Tabela 2: Milho contaminado naturalmente – Teste de laboratório independente

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Tabela 3: Amendoins crus com pele e perfurados, amendoins crus sem pele e amêndoas cruas

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Tabela 4: Dados de recuperação

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Conclusão

Os dados do laboratório independente demonstram que os resultados obtidos usando um método de CLAE oficial da AOAC e o kit de teste FluoroQuant® Afla Plus estão de acordo um com o outro. Além disso, os dados obtidos durante a validação interna demonstra que o kit está de acordo com a CLAE, apresenta boa recuperação para aflatoxina e boa atuação em seu limite de quantificação e é robusto e estável sob variações leves nas condições de operação, conforme pode ser esperado em campo. O kit é rápido e fácil de operar, produzindo resultados quantitativos em menos de 5 minutos. É adequado para uso em campo em instalações de processamento de grãos, instalações de manuseio de rações e alimentos e terminais de exportação, assim como em laboratórios analíticos.



SOBRE O AUTOR

Nome: Donna Houchins, BSc.

Cargo: Química analítica

Formação: Truman State University

Desde 2000: P&D em Química analítica - Romer Labs Inc.

1999-2000: Assistente de laboratório de P&D, Truman State University 

 
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