INTRODUÇÃO
O milho (Zea mays L.) é o cereal mais produzido no mundo, com produção projetada em 1.044 milhões de toneladas na safra de 2017/2018. Essa produção concentra-se principalmente nos EUA, na China e no Brasil, com 370, 216 e 95 milhões de toneladas colhidas, respectivamente (World..., 2017). No Brasil, estimativas indicam que 41,5 milhões de toneladas foram utilizadas para fabricação de rações para animais no ano de 2017 (Efeitos..., 2017), demonstrando que o milho é o cereal mais utilizado como ingrediente de dietas para animais.
O crescimento fúngico e a produção de micotoxinas no milho são influenciados por diversos fatores bióticos e abióticos (Dilkin et al., 2002). O milho brasileiro está frequentemente contaminado com diversas micotoxinas, como aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), fumonisinas (B1 e B2), zearalenona, deoxinivalenol, entre outras (Oliveira et al., 2017). As micotoxinas afetam os animais de forma individual ou sinérgica na presença de mais de uma micotoxina, podendo afetar vários órgãos, como o trato gastrointestinal, o fígado e o sistema imunológico, resultando essencialmente na redução da produtividade das aves e na mortalidade em casos extremos (Murugesan et al., 2015).
Nos últimos anos, houve um vasto desenvolvimento de híbridos de milho geneticamente modificados, aos quais foram inseridos genes de Bacillus thuringiensis, que levam à produção de proteínas tóxicas a algumas ordens de insetos consideradas pragas da cultura do milho. Plantas de milho de híbridos com essa tecnologia sofrem menor ataque de insetos, fazendo com que a planta, teoricamente, seja menos vulnerável aos fungos produtores de micotoxinas (Hammond et al., 2004). Em estudo realizado com 36 cultivares de milho, Pinto et al. (2007) relataram também efeito de diferentes híbridos na incidência de grãos ardidos e mofados, bem como acentuada interação entre as cultivares e o fungo toxigênico Fusarium subglutinans quanto à biossíntese de fumonisina B1 em grãos de milho. Assim, fica evidenciado que a variabilidade genética dos híbridos de milho e sua relação com a contaminação por micotoxinas é um fator relevante na escolha do material genético mais adequado para cultivo.
Não obstante o aspecto micotoxicológico, o milho é o mais importante componente energético das rações (Moreira et al., 1994), mas pode apresentar variações na sua composição nutricional, ocasionadas por fatores como potencial genético, nível de adubação utilizado, fertilidade do solo e condições climáticas (Eyng et al., 2009). Nesse sentido, a informação mais exata e precisa da matriz nutricional dos alimentos é essencial para a formulação de rações com custo mínimo e redução dos riscos de suprimento de níveis marginais ou em excesso, com a finalidade de otimizar a produtividade e maximizar a rentabilidade na produção animal (Silva et al., 2008).
Como consequência desses fatores, a indústria precisa exigir maior qualidade de grãos para evitar a necessidade de uso exagerado de aditivos antimicotoxinas para minimizar os efeitos tóxicos das micotoxinas bem como de óleos e aminoácidos sintéticos para suprir as exigências nutricionais. Considerando que a recomendação de híbridos de milho que atendam a esses requisitos ainda carece de pesquisas, o objetivo deste trabalho foi avaliar as variáveis micotoxicológicas e nutricionais de híbridos de milho com diferentes características que influenciam no custo da ração para frangos de corte.
MATERIAL E MÉTODOS
Empregaram-se 26 híbridos de milho geneticamente modificados, em cultivos extemporâneos (safrinha) (fevereiro a junho) dos anos de 2016 e 2017, em uma área experimental localizada no extremo oeste do estado do Paraná, Brasil (Tab. 1). O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso, com quatro repetições. As parcelas foram constituídas de seis fileiras de 5m de comprimento, com espaçamento de 0,45m e avaliação das quatro fileiras centrais. Após a colheita, foi coletado 1,25kg de grãos de cada parcela, dos quais 250g foram separados visualmente em grãos aparentemente sadios e grãos avariados (Brasil, 2011). As amostras de 1kg foram parcialmente secas em estufa de ar forçado a 55°C, por 48h, moídas empregando-se peneira de 1mm e homogeneizadas.
Uma fração da amostra foi submetida à extração das aflatoxinas (B1+B2+G1+G2) (AFLA), das fumonisinas (B1+B2) (FUM), da zearalenona (ZEA) e do deoxinivalenol (DON) em solução de ACN e H2O, agitada por 20min a 2.500rpm em multivórtex. Uma alíquota do extrato foi injetada em cromatógrafo líquido de alta eficiência 1200 Series Infinity (Agilent, EUA), acoplado a um espectrômetro de massas (LC-MS/MS) 5500 QTRAP (Applied Biosystems, EUA). As análises foram efetuadas seguindo-se os parâmetros propostos por Sulyok et al. (2007), Mallmann et al. (2013) e Berthiller et al. (2005), para AFLA, FUM e ZEA/DON, respectivamente.
A determinação dos valores de energia metabolizável aparente para aves corrigida para balanço de nitrogênio (EMAn), proteína bruta (PB), umidade e os aminoácidos lisina (LisD), metionina (MetD), cistina (CisD) e treonina (TreD) digestíveis para aves foi realizada pelo método de espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS), efetuada pelo Laboratório CEAN Adisseo Brasil e Adisseo France S.A.S. (PNE, 2017). O espectrômetro NIRS XDS (Foss, Dinamarca) utilizado foi calibrado com equações de predição baseadas em análises de aminoácidos, ácido fítico e conteúdo total de fósforo por cromatografia líquida de alta eficiência e em métodos in vivo para determinar a digestibilidade de aminoácidos e EMAn.
Todas as variáveis foram ajustadas para 87% de matéria seca para o cálculo do custo de rações para frangos de corte na fase inicial (do 10o ao 21o dia de idade) (R$/t ração) utilizando-se a planilha PPFR (Unesp, Brasil) de formulação não linear (ração de custo mínimo). As exigências nutricionais seguiram as recomendações de Rostagno et al. (2011); os padrões da agroindústria e os custos dos insumos foram os praticados no mercado regional do oeste do estado do Paraná, em julho de 2017 (Tab. 2). A dose de inclusão de aditivo antimicotoxinas (AAM) foi calculada proporcionalmente ao nível de concentração micotoxicológica de cada híbrido após o ajuste das FUM para fumonisinas totais, que são a soma das fumonisinas livres (FUM) e das fumonisinas ocultas, conforme a equação proposta por Oliveira et al. (2015): fumonisinas totais (mg/kg) = (0,8583+0,5615*FUM)2 . Em seguida, a dose de AAM foi calculada na proporção de 2,5kg de AAM/t de ração para cada 10.000µg/kg de fumonisinas totais, acrescida da proporção de 2,5kg de AAM/t de ração para cada 28µg/kg de AFLA.
Todas as variáveis foram submetidas à análise de variância e à verificação do efeito de blocos. Utilizou-se o teste de Scott-Knott (variáveis paramétricas) para agrupar os híbridos com características semelhantes ou o teste de KruskalWallis (variáveis não paramétricas) por ano de cultivo. Utilizou-se o teste-F (variáveis paramétricas) ou o teste de Mann-Whitney (variáveis não paramétricas) para verificação do efeito de ano. As variáveis foram submetidas à análise de regressão simples e à análise de regressão múltipla pelo procedimento Stepwise para gerar o modelo de predição do custo da ração. Utilizou-se o nível de significância de 5% para todas as análises. Realizou-se uma análise dos componentes principais (PCA). Os dados foram analisados no programa estatístico Statgraphics Centurion XV, versão 15.2.11 (Manugistics Inc., Rockville, MD, EUA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise dos grãos avariados, apesar de o percentual ter sido maior (P< 0,05) no ano de 2016 em relação a 2017, apenas três híbridos tiveram média superior ao limite de classificação para o milho tipo 1, que é de 6% (Brasil, 2011). Em 2016, a distribuição dos híbridos foi em três grupos; em 2017, em dois grupos. Os índices médios variaram entre 1,2 e 10,9% nos dois anos de avaliação, demonstrando que a variabilidade nos percentuais de grãos avariados foi influenciada (P< 0,05) por híbrido e por ano de cultivo (Tab. 3).
Na análise das FUM, a distribuição dos híbridos se deu em três grupos no ano de 2016 e em apenas dois grupos no ano de 2017. As FUM foram detectadas em 90% das amostras e houve interação (P< 0,05) entre os anos de avaliação, em que 19 dos 26 híbridos avaliados tiveram média de concentração maior (P< 0,05) no ano de 2016 em relação a 2017, o que demonstra a variabilidade das FUM nos híbridos em função do ano (Tab. 3). Prevalência, variabilidade e média de concentração por FUM semelhante foram relatadas por Camargos et al. (2000), que compararam 19 híbridos de milho cultivados em campos experimentais em três locais no estado de São Paulo, Brasil, durante a safra 1997/1998 e constataram que todas as amostras estavam contaminadas com FUM, com média de 7470μg/kg (2080-34290μg/kg).
A concentração de FUM nos híbridos, associada à textura dos grãos, não apresentou interação (P> 0,05), característica dos híbridos que vem sendo discutida com relação à susceptibilidade à infestação fúngica (Tab. 4). No entanto, dos cinco híbridos com textura dura, quatro são da tecnologia de transgenia Viptera, os quais tiveram menores (P< 0,05) concentrações de FUM. Quanto mais macia a textura do grão, maior a suscetibilidade a incidências de doenças e infestação por insetos que podem causar injúrias aos grãos e consequentemente favorecer a colonização de fungos (Ono et al., 2006; Buerstmayr et al., 2003; Bútron et al., 2009). Ao avaliarem 20 variedades crioulas de milho da região Sul do Brasil, Oliveira et al. (2009) constataram que quanto maior a proporção de endosperma vítreo, que é mais denso em relação ao farináceo, maior a força necessária até a ruptura do grão e menor a contaminação por Fusarium sp. No entanto, no mesmo estudo, os autores não observaram correlação com a concentração de ZEA, que foi detectada em 75% das amostras (50-640µg/kg). Quanto às classificações dos híbridos por ciclo e tipo, híbridos de ciclo precoce tiveram menores (P< 0,05) concentrações de FUM, e não foi observada interação (P> 0,05) com o tipo de híbrido (Tab. 4).
As AFLA não foram detectadas nas amostras do ano de 2016, mas em 2017 foram detectadas em 17% das amostras (Tab. 3). Essa prevalência foi similar à encontrada por Oliveira et al. (2017), que relataram uma prevalência de 19% em amostras de milho da região Sul do Brasil. As AFLA são produzidas por fungos do gênero Aspergillus e consideradas micotoxinas de grãos armazenados, pois requerem menor atividade de água do que os fungos do gênero Fusarium (Marin et al., 1998), que são produtores de FUM e ZEA, consideradas micotoxinas de campo, as quais, no presente estudo, estiveram mais prevalentes. Provavelmente neste estudo não tenha havido tempo e/ou condições adequadas após a colheita para o desenvolvimento e a produção de AFLA. As variações nas concentrações de AFLA em diferentes híbridos de milho podem estar relacionadas às concentrações do ácido linoleico e da enzima lipoxigenase (Zeringue et al., 1996). Segundo os autores, a lipoxigenação do ácido linoleico seria capaz de produzir aldeídos voláteis com cadeias de seis até 12 carbonos, inibindo ou impedindo o crescimento de fungos e a formação de AFLA.
Em 2016, somente 8% das amostras apresentaram contaminações por ZEA, enquanto em 2017, essa toxina foi detectada em 59% das amostras. Houve diferença de concentração em apenas cinco híbridos nos dois anos (P< 0,05), tendo a maior concentração média (P< 0,05) ocorrido na safrinha de 2017 (Tab. 3). Essas variações são descritas na literatura, em Oliveira et al. (2017), que diagnosticaram prevalência de ZEA de 74%, e em De Souza et al. (2013), que verificaram apenas 12% de prevalência dessa micotoxina.
Não foi detectado DON (≥200µg/kg) nas amostras de milhos cultivados nos dois anos. Esses dados diferenciam-se da prevalência de 33% constatada por Oliveira et al. (2017), porém estão mais próximos dos 4% encontrados por Souza et al. (2013) ao avaliarem 74 amostras de milho coletadas de uma integradora de frangos localizada no Paraná. Grãos que sofreram danos por fungos, fragmentos de grãos e impurezas podem ter maior concentração de micotoxinas que grãos aparentemente sadios (Shetty e Bhat, 1999). No entanto, no presente estudo, observouse fraca correlação linear no ano de 2017 entre grãos avariados e FUM (P≤0,028 e R 2 =0,06), bem como entre grãos avariados e ZEA (P< 0,001 e R2 =0,16), e moderada correlação de postos de Spearman entre grãos avariados e AFLA (P< 0,001 e R=0,42).
Não houve agrupamento dos híbridos para EMAn no ano de 2016 e, em 2017, os híbridos distribuíram-se em três grupos distintos (P< 0,05). Dos 26 híbridos avaliados, 21 tiveram média de EMAn maior (P< 0,05) na safrinha do ano de 2017 em relação ao de 2016. A EMAn média nos dois anos foi de 3264kcal/kg, apresentando interação (P< 0,05) entre os anos (Tab. 5). Rostagno et al. (2011) apontam o valor médio de 3.381kcal/kg para o milho, o qual foi semelhante ao grupo de híbridos com maior EMAn no ano de 2017 no presente estudo. Vieira et al. (2007), ao avaliarem 45 híbridos, constataram EMAn média de 3251kcal/kg, muito semelhante ao resultado deste estudo, porém com maior amplitude de variação (506kcal/kg).
Os resultados de PB dos híbridos de milho distribuíram-se em três grupos em 2016 e quatro grupos em 2017 (Tab. 5). Somente três híbridos tiveram média de PB maior (P< 0,05) na safrinha do ano de 2017 em relação ao de 2016. Contudo, a média de concentração do ano de 2017 foi maior (P< 0,05). Valor médio superior (8,61%) foi encontrado por Piovesan et al. (2010) em trabalho com 45 amostras de grãos de milho na região do oeste do Paraná. Valores inferiores (7,17%) e variação maior (5,82-8,80%) foram reportados por Vieira et al. (2007) em estudo com 45 híbridos, demonstrando que a PB sofre influência de híbrido, safra e região de cultivo. No presente estudo, a PB teve fraca correlação negativa com EMAn (R2 =0,15 e P< 0,001) em 2016 e também em 2017.
Os níveis de LisD, MetD, CisD e TreD nos diferentes híbridos distribuíram-se em dois grupos nas safrinhas de 2016 e 2017, com exceção da TreD, que, em 2016, distribuiu-se em três grupos (Tab. 5). Na média geral por ano, percebeu-se que LisD e TreD foram maiores (P< 0,05) em 2016. MetD teve maior (P< 0,05) concentração em 2017 e CisD não teve efeito de ano de cultivo.
Verificou-se que híbridos com grãos duros tiveram maior (P< 0,05) PB e aminoácidos digestíveis (Tab. 4). Dos cinco híbridos com textura dura, quatro são da tecnologia de transgenia Viptera, os quais tiveram maiores (P< 0,05) concentrações de PB, MetD, CisD, TreD e menor custo da ração (P< 0,05). Quanto ao tipo, constatou-se que híbridos simples modificados e duplos tiveram maiores (P< 0,05) percentuais de PB, MetD, CisD e TreD. Quanto ao ciclo, o precoce teve maiores (P< 0,05) percentuais de PB, LisD, MetD, CisD, TreD e menor (P< 0,05) custo da ração.
O custo da ração foi maior (P< 0,05) no ano de 2016, quando os híbridos se distribuíram em dois grupos. Em 2017 houve três grupos, e a média de custo dos dois anos foi de R$ 680,60 por tonelada (Tab. 5). O custo da ração ajustou-se aos modelos de regressão linear múltipla, nos quais as variáveis FUM, EMAn e PB apresentaram interação (P< 0,05) no ano de 2016, bem como na avaliação conjunta dos dois anos, e FUM, EMAn, PB e grãos avariados apresentaram interação em 2017 (Tab. 6).
As dietas comumente utilizadas na avicultura de corte têm o milho como principal ingrediente e fonte de energia (Moreira et al., 1994), porém constatou-se, no presente estudo, que, além da EMAn, as FUM e a PB também tiveram efeito significativo no custo da ração, inclusive com variações de uma safra para outra. Em 2016, o custo da ração foi fortemente influenciado pela concentração de FUM, pois quanto maior a concentração no milho, maior a inclusão de AAM e, consequentemente, maior o custo da ração. No entanto, em 2017, quando a concentração por FUM foi menor, a EMAn teve maior influência no modelo.
Realizou-se um PCA para cada ano, com as variáveis FUM, grãos avariados, EMAn, PB, LisD, MetD, TreD, CisD e custo da ração, em que dois componentes principais (PCs) foram observados: PC1 e PC2 (Fig. 1). Em 2016, o PC1 e o PC2 contribuíram com 50% e 21%, respectivamente, o que explica 71% da variação total dos dados. Em 2017, o PC1 e o PC2 contribuíram com 57% e 17%, respectivamente, o que esclarece 74% da variação total. Nos dois anos de experimento, houve cinco híbridos com textura dura, dentre os quais quatro, com tecnologia Viptera, formaram um grupo que se correlacionou negativamente ao custo da ração e de FUM. Além disso, é possível observar que quanto menor o percentual de PB e aminoácidos digestíveis, maior é o custo da ração e maior é a concentração de FUM.
Figura 1. Gráfico dos scores (a), por tipo de textura de grão, e loadings (b) para amostras de 26 híbridos de milho cultivados nas safrinhas de 2016 e 2017 analisadas para PCA. Correlação entre grãos avariados, fumonisinas (B1+B2) (FUM), energia metabolizável aparente corrigida para balanço de nitrogênio (EMAn), proteína bruta (PB), aminoácidos digestíveis para aves (LisD, MetD, CisD e TreD) e custo da ração inicial para frangos de corte (R$ ração).
Mesmo que não tenha havido efeito significativo dos aminoácidos digestíveis sobre o custo da ração no modelo de regressão linear múltipla, na PCA é possível visualizar correlação positiva entre PB e aminoácidos digestíveis e correlação negativa entre PB+aminoácidos digestíveis e custo da ração+FUM (Fig. 1).
CONCLUSÃO
A composição micotoxicológica e nutricional é influenciada pelos diferentes híbridos e também pelo ano de cultivo e, por isso, deve ser constantemente monitorada para a produção de rações. A correlação entre grãos avariados e micotoxinas é de fraca magnitude, evidenciando a necessidade de análises laboratoriais para quantificação da concentração de micotoxinas. Altas concentrações de micotoxinas influenciam negativamente no custo da ração, pois requerem a inclusão de aditivos antimicotoxinas. Híbridos com tecnologia Viptera apresentam menor concentração de FUM, maiores percentuais de PB, MetD, CisD e TreD e, consequentemente, produzem ração de custo mais baixo. Híbridos simples modificados e duplos têm maiores percentuais de PB, MetD, CisD e TreD, e híbridos de ciclo precoce têm menor concentração de FUM, maiores percentuais de PB, LisD, MetD, CisD, TreD e produzem ração de menor custo.
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