Mycoplasma aves Venezuela
Isolamento e caracterização molecular de Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae em aves reprodutoras e poedeiras comerciais, na Venezuela
Publicado: 20 de outubro de 2011
Por: V Pérez1*, M Brett1*, H Moscoso2, C Jaramillo3, A Godoy4, E Marcano5, E Saume1, K Garcia1, J Fragozzo1, L Perozo1, J Sandoval1, Z Gutiérrez1
1Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas INIA-CENIAP-Venezuela; 2Laboratorio Avian diagnostic. USA, GA; 3NUTRINA-MERIAL Venezuela; 4Ejercicio Privado USA; 5Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Central de Venezuela
Sumário
Foi realizado um estudo para isolar e identificar as moléculas de Mycoplasma gallisepticum (M.g) e de M. synoviae (M.s) em 28 granjas avícolas da Venezuela: 12 granjas reprodutoras pesadas (RP) e 16 granjas poedeiras comerciais (PC). Das RP, 90% receberam vacina contra M.g (linhagem F), mas não contra M.s. Estudos sorológicos prévios por prova rápida em placa (PRP) e ELISA identificaram 42 lotes positivos, dos quais foram tomados swabs traqueais em caldo Frey para o isolamento do germe, e em cartões FTA® para estudo molecular. Os resultados de ELISA revelaram uma prevalência para M.g. de 73,64% em PC e 54,38 % em RP; para M.s se obteve uma prevalência de 64,12% para PC e 55,87% para RP. O isolamento do patogênico se realizou mediante técnicas convencionais, obtendo 29 linhagens de Mycoplasmas (78,57% das granjas analisadas). Para a identificação genômica se usou PCR, utilizando primers 16S rRNA correspondentes à proteína de matriz, e para a sequenciamento se utilizaram os primers mgc2 que codificam para a proteína citoadesina para M.g. e Ms-vlha que codificam para a proteína hemoaglutinina de M.s, os quais permitem diferenciar linhagens vacinais das linhagens de campo. Como resultado em PC com primers do gene 16S rRNA se obteve 8 linhagens de M.g e 7 de M.s. Na análise de sequência com os primers mgc2 foram obtidas 2 linhagens vacinais (linhagem F) e 2 linhagens de campo; com MS-vlha foram obtidas 7 linhagens de campo. Como resultado em RP com primers do gene 16S rRNA se obteve 11 linhagens para M.g e 3 para M.s. Com primers mgc2 foram obtidas 9 linhagens vacunais (linhagem F) e 2 linhagens de campo; com MS-vlha foram obtidas 3 linhagens de campo. Em conclusão, podemos assegurar a presença de linhagens de campo de M.g e M.s nos lotes de PC e RP, na Venezuela.
Palavras- chave: Isolamento, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, ADN, PCR.
Introdução
Os Mycoplasmas são agentes difíceis de isolar, o que, em muitos casos, impossibilita seu diagnóstico e caracterização adequada (Ricci, 2005). Na Venezuela, a micoplasmose aviária é diagnosticada, geralmente, através de métodos sorológicos e, eventualmente, por PCR, realizados em laboratórios estrangeiros (Godoy, 1999). O isolamento e a caracterização genômica em lotes de aves podem ser utilizados para modificar planos de vacinação, fazê-los mais assertivos ou propor a utilização da antibioticoterapia de maneira mais eficiente em seu controle, já que muitas vezes os Mycoplasmas estão associados a outras doenças. Por isso, a utilização de técnicas avançadas com a PCR e a sequenciamento parcial de nucleótidos são uma ferramenta de grande importância na micoplasmose aviária, conseguindo diagnósticos mais precisos que permitem diferenciar linhagens de campo de linhagens vacinais, o que leva a um melhor conhecimento do patogênico que afeta a populações aviárias (Raviv & Kleven, 2008). O objetivo de nosso trabalho foi isolar e caracterizar as moléculas das linhagens Mycoplasma gallisepticum e/ou Mycoplasma synoviae isoladas de aves reprodutoras e poedeiras comerciais na Venezuela.
Materiais & Métodos
O estudo foi realizado em 28 granjas: 12 granjas de RP com 696 amostras e 16 granjas de PC com 734 amostras, para um total de 1430 amostras. As amostragens se realizaram de maneira intencional, não probabilística, em zonas de alta produção de aves no país. Houve duas fases: Fase de campo: coleta de amostras de sangue, swabs traqueais e amostras em cartões FTA®. Fase de laboratório: foi feita a detecção de anticorpos específicos contra M.g e M.s através das técnicas PRP e ELISA. O isolamento de M.g e M.s se realizou mediante técnicas padronizadas de cultivos (Anônimo, 1994), utilizando swabs traqueais tomados de aves vivas em granjas e em 2 casos de autópsia. A caracterização molecular do M.g e M.s foi levada a cabo mediante a PCR (Moscoso et al., 2004) no INIA-Venezuela e a sequenciamento parcial de nucleótidos (ABI Prism DNA sequencing kit and ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City CA,) no Departamento de Instrumentação Genética Molecular da Universidade da Geórgia, USA. Os DNA extraídos de caldos de Frey positivos ao isolamento foram analisados por PCR com o uso dos primers Invitrogen®: MG-14F 5´ GAG CTA ATC TGT AAA GTT GGT C-3´; MG-13R 5´ GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC-3´ de 186 pb e MSLF 5´ GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC A-3´ e MSLR 5´ CAG TCG TCT CCG AAG TTA ACA A-3´de 214 pb, correspondentes à proteína de matriz como screening. Para o diagnóstico diferencial entre linhagem vacinal e de campo foram usados primers Invitrogen®: MG-c2-F 5´ CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A-3´ e MG-c2-R 5´TAA ACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C-3´ de 237-303 bp; MS vhla-F 5´GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT-3´, MS vhla-R 5´GCT TCT GTT GTA GTT GCT TC-3´ de 316-395 bp. A análise da sequência de nucleótidos se realizou no Laboratório Avian Diagnostic na Geórgia (USA) usando o Lasergene program (DNASTAR, Inc. Madison, WI. e a nucleotide-nucleotide Blast data base NCBI -National Center for Biotechnology Information-).
Resultados & Discussão
Detecção de anticorpos específicos
PRP de 696 amostras em RP se obteve para M.g direta e diluições de níveis entre 62,07-65,66 % e para M.s se manteve em 33,19%. Em PC de 734 amostras para M.g direta e diluições entre 60,49-68,39 % e para M.s 32,43-43,19 %. 90 % de granjas de RP utilizaram vacina contra M.g (linhagem F), não assim as granjas de PC em que seu uso é mais restrito. Para M.s, nenhuma das granjas relataram uso de vacinas, e se observou que as PC mostraram uma maior porcentagem de positividade. No entanto, já foi afirmado que lotes de aves poderiam apresentar reatores não específicos ou falsos positivos, devido a recentes aplicações de vacinas oleosas ou à utilização de biológicos produzidos em tecidos vivos contra outros agentes infecciosos (Kleven, 1994; Contreras, 2000). Em PC, M.s apresentou uma maior porcentagem de positividade ao teste, considerada como indícios de infecções recentes, possivelmente devido a que, neste tipo de análise dos dados, de prevalência global em RP e PC, revela coinfecções de ambos os micro-organismos, no entanto, em muitos casos esta associação passa despercebida devido à maior importância normalmente dada a M.g (Godoy, 1999). Para ELISA nas RP de 537 amostras: M.g 54,38 % e M.s 55,87% de positivos. A soroprevalência em RP foi levemente superior para M.s, embora sabemos que estas aves foram vacinadas em 90 % contra M.g. Para PC em 588 amostras se evidenciou 73,64 % para M.g e 64,12 % para M.s de positivos. Neste caso, a soroprevalência de M.g foi superior; a maior parte destes lotes não receberam vacinações contra M.g nem contra M.s. As IgG, no caso dos Mycoplasmas aviários apresenta-se entre 1 e 6 semanas pós-vacinação ou infecção por linhagens de M.g ou M.s de campo (Ross, 2009). Para as RP vacinadas, se infere que a resposta sorológica se deve ao uso de linhagens vacinais, as quais produzem uma resposta imune forte e detectável por um período superior a 12 semanas (Contreras, 2000, Ricci 2005). Caso contrário, ao que se apresenta nas PC, em que não foi relatado o uso de vacina de M.g, no entanto, foram detectados títulos devidos, possivelmente, à infecção crônica e circulante entre lotes. Para M.s, ambas as populações em estudo não receberam vacinações, por isso os resultados obtidos correspondem à soroconversão por exposição a linhagens de campo presentes nas explorações estudadas.
Detecção de anticorpos específicos
PRP de 696 amostras em RP se obteve para M.g direta e diluições de níveis entre 62,07-65,66 % e para M.s se manteve em 33,19%. Em PC de 734 amostras para M.g direta e diluições entre 60,49-68,39 % e para M.s 32,43-43,19 %. 90 % de granjas de RP utilizaram vacina contra M.g (linhagem F), não assim as granjas de PC em que seu uso é mais restrito. Para M.s, nenhuma das granjas relataram uso de vacinas, e se observou que as PC mostraram uma maior porcentagem de positividade. No entanto, já foi afirmado que lotes de aves poderiam apresentar reatores não específicos ou falsos positivos, devido a recentes aplicações de vacinas oleosas ou à utilização de biológicos produzidos em tecidos vivos contra outros agentes infecciosos (Kleven, 1994; Contreras, 2000). Em PC, M.s apresentou uma maior porcentagem de positividade ao teste, considerada como indícios de infecções recentes, possivelmente devido a que, neste tipo de análise dos dados, de prevalência global em RP e PC, revela coinfecções de ambos os micro-organismos, no entanto, em muitos casos esta associação passa despercebida devido à maior importância normalmente dada a M.g (Godoy, 1999). Para ELISA nas RP de 537 amostras: M.g 54,38 % e M.s 55,87% de positivos. A soroprevalência em RP foi levemente superior para M.s, embora sabemos que estas aves foram vacinadas em 90 % contra M.g. Para PC em 588 amostras se evidenciou 73,64 % para M.g e 64,12 % para M.s de positivos. Neste caso, a soroprevalência de M.g foi superior; a maior parte destes lotes não receberam vacinações contra M.g nem contra M.s. As IgG, no caso dos Mycoplasmas aviários apresenta-se entre 1 e 6 semanas pós-vacinação ou infecção por linhagens de M.g ou M.s de campo (Ross, 2009). Para as RP vacinadas, se infere que a resposta sorológica se deve ao uso de linhagens vacinais, as quais produzem uma resposta imune forte e detectável por um período superior a 12 semanas (Contreras, 2000, Ricci 2005). Caso contrário, ao que se apresenta nas PC, em que não foi relatado o uso de vacina de M.g, no entanto, foram detectados títulos devidos, possivelmente, à infecção crônica e circulante entre lotes. Para M.s, ambas as populações em estudo não receberam vacinações, por isso os resultados obtidos correspondem à soroconversão por exposição a linhagens de campo presentes nas explorações estudadas.
Isolamento e caracterização molecular
Foram obtidos 29 isolamentos de Mycoplasmas em 28 protocolos analisados, observando alta relação com os resultados obtidos na PRP correspondente a infecções recentes e ativas. Foram observadas colônias típicas a microscópio de luz indireta a baixa magnificação (40 X). Realizaram-se algumas modificações como a adição de 2000 UI de penicilina aos caldos Frey em amostras tomadas em campo, para limitar o crescimento de contaminantes, melhorando a observação das colônias. Com a PCR usando primers MG-14F / MG-13R / MSLF e MSLR identificaram-se 19 linhagens de M.g e 10 de M.s. De 12 granjas de RP analisadas resultaram positivas 11 a M.g. (91,67%) e 3 a M.s. (25%). Enquanto que de 16 granjas de PC analisadas, em 8 detectaram M.g. (50%) e em 7 M.s. (43,75%). Usando primers mgc2 e MS-vlha em RP foram identificadas 11 para M.g, e 3 para M.s. Em PC, identificaram-se 4 para M.g, e 7 para M.s. A análise de sequência do gene mgc2 em RP determinou que 9 amostras apresentam porcentagem de identidade de 100% com: linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99; uma amostra com 99,5 % de identidade com linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99; uma amostra com 97,9% de identidade com linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99 quando foram comparadas com linhagens da banco de dados GenBank. O produto da amplificação do gene M.s vlha. não pôde ser sequenciado com o método utilizado. Nas RP vacinadas, a linhagem vacinal compete com as linhagens de campo, por isso poderiam estar presentes ambas. Neste estudo, foi obtida uma linhagem com semelhança de 97,9% com a linhagem F, a qual poderia ser considerada como uma linhagem de campo. As linhagens de M.s não mostraram resultados de sequências. Harada et al. (2009) afirmam que não sempre a análise com este gene pode determinar as diferenças moleculares entre linhagens de campo e linhagens vacinais. Na análise de sequência do gene mgc2 em PC foram obtidas 4 sequências que foram analisadas, observando duas amostras com 100 % de identidade com linhagem F, linhagem Rab E4-08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01; uma amostra com 99 % de identidade com linhagem F e 98,9 % de identidade com linhagem Rab E4 -08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01; uma amostra com 93,7% de identidade com linhagem F, linhagem Rab E4-08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01 do banco de dados do GenBank. Não se conseguiu a sequenciamento dos outros 4 isolados para M.g. Para M.s com M.s vlha se obteve a sequência de 7 amostras; das quais três tiveram uma porcentagem de identidade de 100% com: linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 90,4% com a linhagem H e com linhagem 94011 (Austrália); uma amostra com 99,6% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 90% com a linhagem H e com a linhagem 94011 (Austrália); uma amostra com 98,8% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 89,2% com a linhagem H e com linhagem 94011 (Austrália); duas amostras com 90,4% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04- K4412 (Espanha); 99,2% com a linhagem H, linhagem 94011 (Austrália) e com a linhagem untilclone V8 MSPB. Os resultados confirmam que existe uma ampla variedade de linhagens de Mycoplasmas nestas populações de aves venezuelanas, o que constitui uma problemática de maior dimensão neste tipo de explorações. As linhagens não sequenciadas de M.s em RP e M.g em PC, podem ser devidas a linhagens que diferem das que normalmente são identificadas com o uso dos primers mgc2 e M.s vlha. Estes genes minimizan a possibilidade de reações cruzadas nos diagnósticos de Mycoplasmas por PCR (Takahashi-Omoe et al., 2004), e têm sido aplicados em trabalhos de caracterização molecular de M.g e M.s em frangos (Evans & Leigh, 2008). Nosso trabalho detectou que em 100% dos casos isolados obteve-se resultado de identificação genômica pela técnica de PCR, seja para M.g ou M.s, ou ambos ao mesmo tempo, por isso se comprova que a técnica é eficaz para o diagnóstico das linhagens de Mycoplasma e que pode acontecer uma combinação de ambos os patogênicos dentro de uma mesma população aviária (Godoy, 1999, Ricci, 2005). Para a sequenciamento, os primers mgc2 e o primers M.s vlha conseguem a diferenciação entre linhagens de M.s e M.g e a diferenciação entre linhagens vacinais de M.g (Raviv & Kleven, 2008), ou a identificação de linhagens de vacinas de M.s utilizando o gene vhla (Harada et al., 2009). Não obstante, existem desenhos de outros primers que também podem ser utilizados para a diferenciação de linhagens de vacinas de Mycoplasma gallisepticum ts-11 e linhagem 685 (Evans & Leigh, 2008).
Foram obtidos 29 isolamentos de Mycoplasmas em 28 protocolos analisados, observando alta relação com os resultados obtidos na PRP correspondente a infecções recentes e ativas. Foram observadas colônias típicas a microscópio de luz indireta a baixa magnificação (40 X). Realizaram-se algumas modificações como a adição de 2000 UI de penicilina aos caldos Frey em amostras tomadas em campo, para limitar o crescimento de contaminantes, melhorando a observação das colônias. Com a PCR usando primers MG-14F / MG-13R / MSLF e MSLR identificaram-se 19 linhagens de M.g e 10 de M.s. De 12 granjas de RP analisadas resultaram positivas 11 a M.g. (91,67%) e 3 a M.s. (25%). Enquanto que de 16 granjas de PC analisadas, em 8 detectaram M.g. (50%) e em 7 M.s. (43,75%). Usando primers mgc2 e MS-vlha em RP foram identificadas 11 para M.g, e 3 para M.s. Em PC, identificaram-se 4 para M.g, e 7 para M.s. A análise de sequência do gene mgc2 em RP determinou que 9 amostras apresentam porcentagem de identidade de 100% com: linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99; uma amostra com 99,5 % de identidade com linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99; uma amostra com 97,9% de identidade com linhagem F, linhagem E4-08 (Egito), linhagem K5152AC01 e com linhagem K4781ATK99 quando foram comparadas com linhagens da banco de dados GenBank. O produto da amplificação do gene M.s vlha. não pôde ser sequenciado com o método utilizado. Nas RP vacinadas, a linhagem vacinal compete com as linhagens de campo, por isso poderiam estar presentes ambas. Neste estudo, foi obtida uma linhagem com semelhança de 97,9% com a linhagem F, a qual poderia ser considerada como uma linhagem de campo. As linhagens de M.s não mostraram resultados de sequências. Harada et al. (2009) afirmam que não sempre a análise com este gene pode determinar as diferenças moleculares entre linhagens de campo e linhagens vacinais. Na análise de sequência do gene mgc2 em PC foram obtidas 4 sequências que foram analisadas, observando duas amostras com 100 % de identidade com linhagem F, linhagem Rab E4-08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01; uma amostra com 99 % de identidade com linhagem F e 98,9 % de identidade com linhagem Rab E4 -08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01; uma amostra com 93,7% de identidade com linhagem F, linhagem Rab E4-08 (Egito), linhagem K4781ATK99, linhagem K5058ETK01 e com a linhagem K5152AC01 do banco de dados do GenBank. Não se conseguiu a sequenciamento dos outros 4 isolados para M.g. Para M.s com M.s vlha se obteve a sequência de 7 amostras; das quais três tiveram uma porcentagem de identidade de 100% com: linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 90,4% com a linhagem H e com linhagem 94011 (Austrália); uma amostra com 99,6% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 90% com a linhagem H e com a linhagem 94011 (Austrália); uma amostra com 98,8% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04-K4412 (Espanha); 89,2% com a linhagem H e com linhagem 94011 (Austrália); duas amostras com 90,4% de identidade com linhagem EsPKUAF08 (Paquistão), linhagem B95-04- K4412 (Espanha); 99,2% com a linhagem H, linhagem 94011 (Austrália) e com a linhagem untilclone V8 MSPB. Os resultados confirmam que existe uma ampla variedade de linhagens de Mycoplasmas nestas populações de aves venezuelanas, o que constitui uma problemática de maior dimensão neste tipo de explorações. As linhagens não sequenciadas de M.s em RP e M.g em PC, podem ser devidas a linhagens que diferem das que normalmente são identificadas com o uso dos primers mgc2 e M.s vlha. Estes genes minimizan a possibilidade de reações cruzadas nos diagnósticos de Mycoplasmas por PCR (Takahashi-Omoe et al., 2004), e têm sido aplicados em trabalhos de caracterização molecular de M.g e M.s em frangos (Evans & Leigh, 2008). Nosso trabalho detectou que em 100% dos casos isolados obteve-se resultado de identificação genômica pela técnica de PCR, seja para M.g ou M.s, ou ambos ao mesmo tempo, por isso se comprova que a técnica é eficaz para o diagnóstico das linhagens de Mycoplasma e que pode acontecer uma combinação de ambos os patogênicos dentro de uma mesma população aviária (Godoy, 1999, Ricci, 2005). Para a sequenciamento, os primers mgc2 e o primers M.s vlha conseguem a diferenciação entre linhagens de M.s e M.g e a diferenciação entre linhagens vacinais de M.g (Raviv & Kleven, 2008), ou a identificação de linhagens de vacinas de M.s utilizando o gene vhla (Harada et al., 2009). Não obstante, existem desenhos de outros primers que também podem ser utilizados para a diferenciação de linhagens de vacinas de Mycoplasma gallisepticum ts-11 e linhagem 685 (Evans & Leigh, 2008).
Conclusões
Os resultados sorológicos, de isolamento e identificação genômica de M.g e/ou M.s, indicam um desafio considerável em campo na explorações avícolas venezuelanas estudadas, demonstrando a presença de linhagens vivas (vacinais e/ou de campo) nas populações aviárias.
Bibliografia
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Raviv Z & Kleven SH. 2008. Desarrollo de técnicas diagnósticas mediante la reacción en cadena por la polimerasa utilizando el sistema TaqMan para la detección de cuatro micoplasmas aviares patogénicos. Desarrollo de técnicas diagnósticas Mediante la reacción en cadena por la polimerasa Utilizando el sistema TaqMan para la detección de cuatro micoplasmas aviares patogénicos. Enfermedades aviares 53(1):103-107.
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